Denne protokol indeholder en trinvis procedure for reproducerbar generering, vedligeholdelse og ældning af cerebrale organoider afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSC’er). Denne metode muliggør dyrkning og modning af cerebrale organoider i længere perioder, hvilket letter modellering af processer involveret i hjernens aldring og aldersrelateret patogenese.
De aktuelt tilgængelige dyre- og cellulære modeller rekapitulerer ikke fuldt ud kompleksiteten af ændringer, der finder sted i den aldrende menneskelige hjerne. En nylig udvikling af procedurer, der beskriver dannelsen af humane cerebrale organoider, afledt af humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er), har potentialet til fundamentalt at transformere evnen til at modellere og forstå aldring af den menneskelige hjerne og relaterede patogene processer. Her præsenteres en optimeret protokol til generering, vedligeholdelse, aldring og karakterisering af humane iPSC-afledte cerebrale organoider. Denne protokol kan implementeres for at generere hjerneorganoider på en reproducerbar måde og fungerer som en trinvis vejledning, der indeholder de nyeste teknikker, der resulterer i forbedret organoid modning og aldring i kultur. Specifikke problemer relateret til organoid modning, nekrose, variabilitet og batcheffekter behandles. Samlet set vil disse teknologiske fremskridt muliggøre modellering af hjernens aldring i organoider afledt af en række unge og ældre menneskelige donorer såvel som personer, der er ramt af aldersrelaterede hjernesygdomme, hvilket muliggør identifikation af fysiologiske og patogene mekanismer for menneskets hjerne aldring.
Aldringssygdomsmodeller er blevet mere og mere relevante, da menneskets forventede levetid fortsætter med at stige. Store genomiske undersøgelser har afdækket ældre populationer med dysregulering af molekylære processer og genetiske ændringer, der påvirker livskvaliteten1. Aldringsprocessen er kendetegnet ved et generelt tab af funktionalitet af organismen, herunder tab af kognitiv funktion, øget risiko for neurodegenerative lidelser og et væld af kroniske sygdomme2.
Nuværende cellekulturteknikker repræsenterer ikke passende aldringens multifaktorielle karakter, da disse dysfunktioner ikke kan replikeres korrekt ved hjælp af mutationer, toksiner eller infektioner3. Dyremodeller, der udforsker aldringsprocessen, er ofte forbundet med lange forsøgstider og høje omkostninger, men bringer også etiske overvejelser med sig. Brug af inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) fra patienter kan belyse de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdomsprogression, da iPSC’er giver mulighed for den naturlige udvikling af celler til modent væv3. iPSC’er er blevet arbejdshesten i mange laboratorier, der undersøger neurodegenerative lidelser, da den cellulære omprogrammering af høstede celler ikke synes at slette donorernes sygdoms- eller aldringsaftryk4. Disse aftryk rekapitulerer cellulære fænotyper, der er blevet demonstreret i menneske- og dyremodeller, hvilket gør iPSC’er egnede til at undersøge individuel cellulær forringelse af det meget tætte hjernevæv 5,6. IPSC-afledte organoider er blevet den fremtrædende model for tredimensionel dyrkning af væv, hvilket muliggør mere komplekse celle-til-celle-interaktioner og en forbedret udviklingsmæssig rekapitulation. Selvom organoider primært anvendes til udviklingsdata, er organoider i stigende grad blevet anvendt til sygdomsmodellering, specifikt modeller for inflammation, neurodegeneration og aldring7. Baseret på tidligere iPSC-undersøgelser bevarer organoider sygdomsfænotyper og cellulære fænotyper inden for den fysiologiske kontekst af vævslignende netværksforbindelser 8,9. Imidlertid kan dyrkning af tredimensionelt væv af visse dimensioner være udfordrende, især i længere perioder.
Dette arbejde præsenterer en detaljeret metode til reproducerbar generering af cerebrale organoider, der gør det muligt for vævet at modnes væsentligt i størrelse i længere perioder. Cerebral organoid skabelse er forblevet relativt standardiseret og vedtager metoder fra flere fremtrædende protokoller10,11. Der er dog foreslået flere ændringer for forbedret differentiering og vedligeholdelse. Disse alternative metoder omfatter anvendelse af neurogene faktorer til forbedring af neural differentiering12, yderligere stilladser til forbedret næringsstofudveksling, der fremmer cellulær levetid 13 og lav ren stressagitation for langvarig kultur og vækst14. Disse forbedringer er blevet indarbejdet i denne metode til at udvikle modne organoider, der er i stand til at udtrykke neurodegenerative og aldrende fænotyper.
Den standardiserede dannelse af EB’er er et kritisk skridt i den reproducerbare omdannelse af pluripotente stamceller til hjerneorganoider. Kraftaggregeringen af stamceller i enkeltvæv kan variere afhængigt af geometrien af de konkave brønde, såtæthed og brøndbehandling. Selvom den nuværende metode nævner et diameterområde på 500-600 μm efter 6 dage, udelukker disse diametre ikke andre diametre med korrekt organoiddannelse, da mange andre diametre har vist sig vellykkede. Imidlertid har varierende diametre vist sig at påvirke differentieringshastigheder og succes29. Af hensyn til reproducerbarheden anbefales diametervariationer under 50 μm stærkt20. Derudover kan antallet af neurale induktionsdage forlænges fra 6 til 10 dage for at give EB’erne mulighed for at vokse i diameter, da brugen af SMAD-hæmmere har vist sig effektivt at producere og opretholde neuroepiteldannelse efter kun 5 dages eksponering30. I fravær af SMAD-hæmmere kan neural induktion give inkonsekvente resultater, hvilket kræver længere induktionsperioder. SMAD-hæmmere citeret i dette arbejde er de mest effektive, men andre dorsomorphin og TGF-β små molekyler kan anvendes i deres effektive koncentration.
Kældermembranmatrixen giver et fremragende substrat til vækst og kan administreres forskelligt. Tidlige anvendelser af matrixen omfattede basalmembranen som en brøndbelægning31. Anvendelsen af matrixen til indlejring af væv viste sig imidlertid at forbedre differentiering og modning i disse væv32. For organoider har brugen af matrixen vist sig at forbedre EB-differentiering i organoider, fremme modning og forlænge dyrkningsperioder33. Mens organoider stadig kan dannes uden matrixen, da mange grupper har stræbt efter at opnå en matrixfri vævskultur 34,35, har undersøgelser vist, at de matrixindlejrede organoider har en større chance for langvarige dyrkningstider og kræver mindre vedligeholdelse36. Dimple-metoden til indlejring giver lige dækning af organoidoverfladen, hvilket sikrer lignende diffusion, adgang til næringsstoffer og reproducerbar differentiering. Alternativt kan kuppelindlejring anvendes til fuldt ud at indkapsle organoiderne37.
Overførslen af EB’erne til membranmatrixfordybningerne er et kritisk skridt. Selvom en 1 ml pipettespids har en bred nok åbning til at overføre EB’erne, foretrækkes en 200 μL spids for nem overførsel. De 200 μL spidser skal skæres for at skabe en tilstrækkelig stor åbning, hvilket sikrer en glat kant for at reducere forskydningsspændingen ved pipettering. Alternativt findes der bredborede 200 μL spidser for nem overførsel. Pipettering skal udføres langsomt, da hurtig pipettering kan forstyrre den organoide periferi og hindre korrekt vækst. Der skal lægges særlig vægt på at sikre, at der overføres tilstrækkeligt medium til at give næringsstoffer. For lidt medium risikerer at tørre organoiden ud og forårsage nekrose. Overførsel af EB med for meget kulturmedie kan medføre, at matrixen bliver for fortyndet og undlader at indkapsle organoiden sikkert. Ideelt set må matrixen ikke fortyndes med mere end 50% for at sikre dens polymerisation og funktion som en ECM for EB’erne. Hvis indlejringen ikke lykkes, kan EB gendannes og genindkapsles. Genindkapsling i den friske matrix kan gøres på ethvert tidspunkt for at give organoiden yderligere støtte.
I lighed med matrixindlejring til stilladser giver PLGA-fibre yderligere støtte til tredimensionel vækst. Oprindeligt inkorporeret for at producere aflange organoider og øge overfladearealet38, er inkorporeringen af PLGA-fibre gradvist blevet identificeret som et ekstra værktøj til forbedring af organoiddifferentiering og modning39. Da flere laboratorier ser ud til at reducere brugen af matrixen eller afskaffe den helt, giver de selvorganiserende egenskaber af organoider, der understøttes af de inkorporerede fibre, nok stilladser til tredimensionel vævsdannelse og differentiering39. Her blev begge metoder kombineret for at øge chancerne for langsigtet kultur38,39. Inkorporeringen af fibre under den indledende aggregering er kritisk, da disse muligvis ikke introduceres på et senere tidspunkt. Efter centrifugering vil kontrol af, at et par fibre er blandt de aggregerede celler, sikre, at en fiber er inkorporeret i EB. Hvis det ikke lykkes, bør en blid aspiration af brønden og gencentrifugering sikre blanding.
Et andet kritisk trin i organoid vedligeholdelse er introduktionen af en orbital shaker for bedre medieperfusion. I tidlige iterationer af organoidprotokoller blev en roterende bioreaktor brugt til at skabe agitation11. En orbital shaker ved 90 o / min giver tilstrækkelig omrøring uden at ødelægge matrixdråben eller beskadige organoid morfologi. Nogle grupper afholder sig fra at bruge matrixstilladset, men bevarer rysteruro for at skabe et passende miljø34. Som med alle protokoller skal rotationshastigheden justeres afhængigt af rysteren for at reducere mængden af forskydningsspænding. Hvis der blev valgt en kuppelindlejring, kunne en vippet ryster anvendes til at reducere mængden af forskydningsspænding11,34.
Samlet set giver integrationen af flere udvalgte teknikker en robust metode til iPSC-afledt organoiddannelse. Der er flere måder at skabe og vedligeholde organoider på, men mange af dem fokuserer på tidlige differentieringsbaner. I dette arbejde blev flere forskellige teknikker kombineret til kulturorganoider i længere perioder, forbi differentieringsfasen og ind i en modningsperiode, hvor aldrende fænotyper kan begynde at udvikle sig. Inkorporering af disse teknikker muliggør langvarig modning uden behov for eksogene biologiske faktorer for at opretholde kulturerne, bevare selvorganiseringen og den naturlige progression af aldring.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det nederlandske organ-on-chip-initiativ, et NWO gravitationsprojekt (024.003.001) finansieret af den nederlandske regerings ministerium for uddannelse, kultur og videnskab. D.C.B. anerkender heldigvis den økonomiske støtte fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) i form af et ph.d.-stipendium.
2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |