Detta protokoll tillhandahåller en steg-för-steg-procedur för reproducerbar generering, underhåll och åldrande av cerebrala organoider härrörande från humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC). Denna metod möjliggör odling och mognad av cerebrala organoider under längre perioder, vilket underlättar modelleringen av processer som är involverade i hjärnans åldrande och åldersrelaterad patogenes.
De för närvarande tillgängliga djur- och cellmodellerna rekapitulerar inte helt komplexiteten hos förändringar som sker i den åldrande mänskliga hjärnan. En ny utveckling av procedurer som beskriver genereringen av humana cerebrala organoider, härledda från humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), har potential att fundamentalt förändra förmågan att modellera och förstå åldrandet av den mänskliga hjärnan och relaterade patogena processer. Här presenteras ett optimerat protokoll för att generera, underhålla, åldra och karakterisera humana iPSC-härledda cerebrala organoider. Detta protokoll kan implementeras för att generera hjärnorganoider på ett reproducerbart sätt och fungerar som en steg-för-steg-guide, som innehåller de senaste teknikerna som resulterar i förbättrad organoidmognad och åldrande i kulturen. Specifika frågor relaterade till organoid mognad, nekros, variabilitet och batcheffekter behandlas. Sammantaget kommer dessa tekniska framsteg att möjliggöra modellering av hjärnans åldrande i organoider härrörande från en mängd unga och åldrade mänskliga givare, liksom individer som lider av åldersrelaterade hjärnsjukdomar, vilket möjliggör identifiering av fysiologiska och patogena mekanismer för mänsklig hjärnåldring.
Åldrande sjukdomsmodeller har blivit alltmer relevanta eftersom människans livslängd fortsätter att öka. Storskaliga genomiska studier har avslöjat åldrade populationer med dysreglering av molekylära processer och genetiska förändringar som påverkar livskvaliteten1. Åldringsprocessen kännetecknas av en allmän förlust av organismens funktionalitet, inklusive förlust av kognitiv funktion, ökad risk för neurodegenerativa störningar och en mängd kroniska sjukdomar2.
Nuvarande cellodlingstekniker representerar inte på lämpligt sätt åldrandets multifaktoriella natur, eftersom dessa dysfunktioner inte kan replikeras korrekt genom att använda mutationer, toxiner eller infektioner3. Djurmodeller som utforskar åldrandeprocessen är ofta förknippade med långa försökstider och höga kostnader, men tar också etiska överväganden med sig. Användning av inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) från patienter kan belysa de molekylära mekanismer som ligger till grund för sjukdomsprogression eftersom iPSC möjliggör den naturliga utvecklingen av celler till mogen vävnad3. iPSC har blivit arbetshästen i många laboratorier som undersöker neurodegenerativa störningar, eftersom cellulär omprogrammering av skördade celler inte verkar radera givarnas sjukdom eller åldrande avtryck4. Dessa avtryck rekapitulerar cellulära fenotyper som har visats i human- och djurmodeller, vilket gör iPSC lämpliga för att undersöka individuell cellulär försämring av den mycket täta hjärnvävnaden 5,6. IPSC-härledda organoider har blivit den främsta modellen för tredimensionell odling av vävnad, vilket möjliggör mer komplexa cell-till-cell-interaktioner och en förbättrad utvecklingsrekapitulation. Även om de främst används för utvecklingsdata har organoider i allt högre grad tillämpats mot sjukdomsmodellering, särskilt modeller för inflammation, neurodegeneration och åldrande7. Baserat på tidigare iPSC-studier behåller organoider sjukdomsfenotyper och cellulära fenotyper inom det fysiologiska sammanhanget av vävnadsliknande nätverksanslutningar 8,9. Att odla tredimensionell vävnad av vissa dimensioner kan dock vara utmanande, särskilt under längre perioder.
Detta arbete presenterar en detaljerad metod för reproducerbar generering av cerebrala organoider som gör att vävnaden kan mogna väsentligt i storlek under längre perioder. Cerebral organoidskapande har förblivit relativt standardiserad och antagit metoder från flera framstående protokoll10,11. Flera modifieringar har dock föreslagits för förbättrad differentiering och underhåll. Dessa alternativa metoder inkluderar användning av neurogena faktorer för att förbättra neural differentiering12, ytterligare byggnadsställningar för förbättrat näringsutbyte som främjar cellulär livslängd13 och låg ren stressagitation för långvarig kultur och tillväxt14. Dessa förbättringar har införlivats i denna metod för att utveckla mogna organoider som kan uttrycka neurodegenerativa och åldrande fenotyper.
Den standardiserade bildningen av EBs är ett kritiskt steg i den reproducerbara omvandlingen av pluripotenta stamceller till hjärnorganoider. Kraftaggregeringen av stamceller i singulära vävnader kan variera beroende på geometrin hos de konkava brunnarna, sådddensitet och brunnsbehandling. Även om den nuvarande metoden citerar ett diameterområde på 500-600 μm efter 6 dagar, utesluter dessa diametrar inte andra diametrar med korrekt organoidbildning, eftersom många andra diametrar har visat sig framgångsrika. Varierande diametrar har dock visat sig påverka differentieringshastigheter och framgång29. För reproducerbarhetsändamål rekommenderas starkt diametervariationer under 50 μm20. Dessutom kan antalet neurala induktionsdagar förlängas från 6 till 10 dagar för att möjliggöra EB: erna att växa i diameter, eftersom användningen av SMAD-hämmare har visat sig effektivt producera och upprätthålla neuroepitelbildning efter bara 5 dagars exponering30. I frånvaro av SMAD-hämmare kan neural induktion ge inkonsekventa resultat, vilket kräver längre induktionsperioder. SMAD-hämmare som citeras i detta arbete är de mest effektiva, men andra dorsomorfin och TGF-β små molekyler kan användas vid deras effektiva koncentration.
Basalmembranmatrisen ger ett utmärkt substrat för tillväxt och kan administreras annorlunda. Tidiga användningar av matrisen inkluderade basalmembranet som en brunnsbeläggning31. Användningen av matrisen för inbäddning av vävnad visade sig dock förbättra differentiering och mognad i dessa vävnader32. För organoider har användningen av matrisen visat sig förbättra EB-differentiering till organoider, främja mognad och förlänga odlingsperioder33. Medan organoider fortfarande kan bildas utan matrisen, eftersom många grupper har strävat efter att uppnå en matrisfri vävnadskultur 34,35, har studier visat att de matrisinbäddade organoiderna har större chans att förlänga odlingstiderna och kräver mindre underhåll36. Den dimple metoden för inbäddning ger lika täckning av organoidytan, vilket säkerställer liknande diffusion, tillgång till näringsämnen och reproducerbar differentiering. Alternativt kan kupolinbäddning användas för att helt kapsla in organoiderna37.
Överföringen av EB: erna till membranmatrisgroparna är ett kritiskt steg. Även om en 1 ml pipettspets har en tillräckligt bred öppning för att överföra EB: erna, föredras en 200 μL spets för enkel överföring. Spetsarna på 200 μl måste skäras för att skapa en tillräckligt stor öppning, vilket säkerställer en jämn kant för att minska skjuvspänningen vid pipettering. Alternativt finns bredborrade 200 μL-spetsar för enkel överföring. Pipettering måste göras långsamt, eftersom snabb pipettering kan störa organoidperiferin och hindra korrekt tillväxt. Särskild uppmärksamhet måste ägnas åt att säkerställa att tillräckligt medium överförs för att ge näringsämnen. För lite medium riskerar att torka ut organoiden och orsaka nekros. Överföring av EB med för mycket odlingsmedia kan orsaka att matrisen blir för utspädd och misslyckas med att kapsla in organoiden säkert. Helst får matrisen inte spädas med mer än 50% för att säkerställa dess polymerisation och fungera som en ECM för EB: erna. Om inbäddningen misslyckas kan EB återställas och kapslas in igen. Re-inkapsling i den färska matrisen kan göras när som helst för att ge organoiden ytterligare stöd.
I likhet med matrisinbäddning för byggnadsställningar ger PLGA-fibrer ytterligare stöd för tredimensionell tillväxt. Ursprungligen införlivat för att producera långsträckta organoider och öka ytan38, har införlivandet av PLGA-fibrer gradvis identifierats som ett ytterligare verktyg för att förbättra organoiddifferentiering och mognad39. Eftersom fler laboratorier ser ut att minska användningen av matrisen eller avskaffa den helt och hållet, ger de självorganiserande egenskaperna hos organoider som stöds av de införlivade fibrerna tillräckligt med byggnadsställningar för tredimensionell vävnadsskapande och differentiering39. Här kombinerades båda metoderna för att öka chanserna för långsiktig kultur38,39. Inkorporeringen av fibrer under den initiala aggregeringen är kritisk, eftersom dessa kanske inte introduceras i ett senare skede. Efter centrifugering kommer kontroll av att ett par fibrer finns bland de aggregerade cellerna att säkerställa att en fiber införlivas i EB. Om det inte lyckas bör en mild aspiration av brunnen och omcentrifugering säkerställa blandning.
Ett annat kritiskt steg i organoidunderhåll är introduktionen av en orbital shaker för bättre mediaperfusion. I tidiga iterationer av organoidprotokoll användes en snurrande bioreaktor för att skapa agitation11. En orbitalskakare vid 90 rpm ger tillräcklig omrörning utan att förstöra matrisdroppen eller skada organoidmorfologin. Vissa grupper avstår från att använda matrisställningen men behåller shakeragitation för att ge en lämplig miljö34. Som med alla protokoll måste rotationshastigheten justeras beroende på skakapparaten för att minska mängden skjuvspänning. Om en kupolinbäddning valdes kunde en lutande skakapparat användas för att minska mängden skjuvspänning11,34.
Sammantaget ger integrationen av flera utvalda tekniker en robust metod för iPSC-härledd organoidbildning. Det finns flera sätt att skapa och underhålla organoider, men många av dem fokuserar på tidiga differentieringsbanor. I detta arbete kombinerades flera olika tekniker för att odla organoider under längre perioder, förbi differentieringsfasen och in i en mognadsperiod där åldrande fenotyper kan börja utvecklas. Att införliva dessa tekniker möjliggör långvarig mognad utan behov av exogena biologiska faktorer för att upprätthålla kulturerna, behålla självorganisationen och den naturliga utvecklingen av åldrandet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Netherlands Organ-on-Chip Initiative, ett NWO Gravitation-projekt (024.003.001) finansierat av ministeriet för utbildning, kultur och vetenskap i Nederländernas regering. D.C.B. erkänner tack och lov det ekonomiska stödet från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) i form av ett doktorandstipendium.
2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |