Bedömning av förändringar i synaptisk plasticitet med hjälp av en vaken sluten huvudskademodell av mild traumatisk hjärnskada

Summary

Här demonstreras hur en vaken sluten huvudskademodell kan användas för att undersöka effekterna av upprepad mild traumatisk hjärnskada (r-mTBI) på synaptisk plasticitet i hippocampus. Modellen replikerar viktiga egenskaper hos r-mTBI hos patienter och används tillsammans med in vitro elektrofysiologi.

Abstract

Milda traumatiska hjärnskador (mTBI) är ett vanligt hälsoproblem i Nordamerika. Det finns ett ökande tryck att använda ekologiskt giltiga modeller av mTBI med stängt huvud i den prekliniska miljön för att öka översättbarheten till den kliniska populationen. ACHI-modellen (Awake Closed-headed Injury) använder en modifierad kontrollerad kortikal slaganordning för att leverera sluten huvudskada, vilket inducerar kliniskt relevanta beteendeunderskott utan behov av kraniotomi eller användning av ett bedövningsmedel.

Denna teknik inducerar normalt inte dödsfall, skallfrakturer eller hjärnblödningar och är mer förenlig med att vara en mild skada. Faktum är att ACCHI-procedurens milda karaktär gör den idealisk för studier som undersöker repetitiv mTBI (r-mTBI). Växande bevis tyder på att r-mTBI kan resultera i en kumulativ skada som ger beteendemässiga symptom, neuropatologiska förändringar och neurodegeneration. r-mTBI är vanligt hos ungdomar som idrottar, och dessa skador uppstår under en period av robust synaptisk omorganisation och myelinisering, vilket gör den yngre befolkningen särskilt sårbar för de långsiktiga influenserna av r-mTBI.

Vidare förekommer r-mTBI i fall av våld i nära relationer, ett tillstånd för vilket det finns få objektiva screeningåtgärder. I dessa experiment utvärderades synaptisk funktion i hippocampus hos unga råttor som hade upplevt r-mTBI med hjälp av ACHI-modellen. Efter skadorna användes en vävnadsskivare för att göra hippocampus skivor för att utvärdera dubbelriktad synaptisk plasticitet i hippocampus antingen 1 eller 7 dagar efter r-mTBI. Sammantaget ger ACCHI-modellen forskare en ekologiskt giltig modell för att studera förändringar i synaptisk plasticitet efter mTBI och r-mTBI.

Introduction

Traumatisk hjärnskada (TBI) är ett betydande hälsoproblem, med ~ 2 miljoner fall i Kanada och USA varje år ^1,2. TBI påverkar alla åldersgrupper och kön och har en incidens som är större än någon annan sjukdom, särskilt bröstcancer, aids, Parkinsons sjukdom och multipel skleros³. Trots förekomsten av TBI är dess patofysiologi fortfarande dåligt förstådd och behandlingsalternativen är begränsade. Delvis beror detta på att 85% av alla TBI klassificeras som milda (mTBI), och mTBI har tidigare ansetts ge endast begränsade och övergående beteendeförändringar utan långsiktiga neuropsykiatriska konsekvenser ^4,5. Det är nu erkänt att mTBI-återhämtning kan ta veckor till år^5,6, utlösa allvarligare neurologiska tillstånd^4, och att även upprepade “sub-hjärnskakning” effekter påverkar hjärnan⁷. Detta är alarmerande eftersom idrottare i sporter som hockey / fotboll har >10 huvud sub-hjärnskakningseffekter per match / träningspass 7,8,9,10.

Ungdomar har den högsta förekomsten av mTBI, och i Kanada kommer ungefär en av 10 tonåringar att söka vård för en sportrelaterad hjärnskakning årligen^11,12. I verkligheten kan varje sub-hjärnskakande huvudkollision eller mTBI orsaka diffus skada på hjärnan, och detta kan också skapa ett mer sårbart tillstånd för efterföljande skador och / eller allvarligare neurologiska tillstånd 13,14,15,16,17. I Kanada erkänns det juridiskt via Rowans lag att tidigare skada kan öka hjärnans sårbarhet för ytterligare skada¹⁸, men mekanistisk förståelse av r-mTBI är fortfarande sorgligt otillräcklig. Det är dock tydligt att singel och r-mTBI kan påverka inlärningsförmågan under skolår 19,20, ha könsspecifika resultat 21,22,23,2 ⁴ och försämra kognitiv kapacitet senare i livet^16,25,26. Faktum är att kohortanalyser starkt associerar r-mTBI tidigt i livet med demens senare på^27,28. r-mTBI är också potentiellt associerad med kronisk traumatisk encefalopati (CTE), som kännetecknas av ackumulering av hyperfosforylerat tauprotein och progressiv kortikalatrofi och utfälls av signifikant inflammation 27,29,30,31. Även om kopplingarna mellan r-mTBI och CTE för närvarande är kontroversiella³², kommer denna modell att göra det möjligt att utforska dem mer detaljerat i en preklinisk miljö.

En mTBI beskrivs ofta som en “osynlig skada”, eftersom den förekommer i en sluten skalle och är svår att upptäcka även med moderna bildtekniker^33,34. En exakt experimentell modell av mTBI bör följa två principer. Först bör den rekapitulera de biomekaniska krafter som normalt observeras i den kliniska populationen³⁵. För det andra bör modellen inducera heterogena beteendemässiga resultat, något som också är mycket vanligt i kliniska populationer^36,37,38. För närvarande tenderar majoriteten av prekliniska modeller att vara allvarligare, med kraniotomi, stereotaktiskt huvudstöd, anestesi och kontrollerade kortikala effekter (CCI) som ger betydande strukturella skador och mer omfattande beteendeunderskott än normalt observerade kliniskt³³. Ett annat problem med många prekliniska modeller av hjärnskakning som involverar kraniotomier är att denna procedur i sig skapar inflammation i hjärnan, och detta kan förvärra mTBI-symtom och neuropatologi från eventuell efterföljande skada^39,40. Anestesi introducerar också flera komplexa förvirringar, inklusive att minska inflammation 41,42,43, modulerande mikroglialfunktion⁴⁴, glutamatfrisättning⁴⁵, Ca²⁺ inträde genom NMDA-receptorer 46^, intrakraniellt tryck och cerebral metabolism ⁴⁷. Anestesi introducerar ytterligare förvirringar genom att öka permeabiliteten för blod-hjärnbarriären (BBB), tau-hyperfosforylering och kortikosteroidnivåer, samtidigt som kognitiv funktion minskas 48,49,50,51. Dessutom utgör diffusa, slutna huvudskador den stora majoriteten av kliniska mTBI⁵². De tillåter också en att bättre studera de många faktorer som kan påverka beteendemässiga resultat, inklusive kön²¹, 53 år, intervall mellan skador¹⁵, svårighetsgrad⁵⁴ och antalet skador²³.

Riktningen för de accelererande / retardativa krafterna (vertikal eller horisontell) är också en viktig faktor för beteendemässiga och molekylära resultat. Forskning från Mychasiuk och kollegor har jämfört två modeller av diffus mTBI med stängt huvud: viktfall (vertikala krafter) och sidopåverkan (horisontella krafter)⁵⁵. Både beteendemässiga och molekylära analyser avslöjade heterogena modell- och könsberoende resultat efter mTBI. Således är djurmodeller som hjälper till att undvika kirurgiska ingrepp, samtidigt som de innehåller linjära och rotationskrafter, mer representativa för de fysiologiska förhållanden under vilka dessa skador normalt uppträder^33,56. ACHI-modellen skapades som svar på detta behov, vilket möjliggör snabb och reproducerbar induktion av mTBI hos råttor samtidigt som man undviker procedurer (dvs. anestesi) som är kända för att snedvrida könsskillnader⁵⁷.

Protocol

Godkännande för alla djurförsök gavs av University of Victoria Animal Care Committee i enlighet med Canadian Council on Animal Care (CCAC) standarder. Alla hanråttor av Long-Evans föddes upp internt eller köptes (se materialtabellen). 1. Inhysnings- och avelsförhållanden Låt djuren acklimatisera sig till sin inhysningsmiljö i 1 vecka före avvänjning på postnatal dag (PND) 21. Håll råttorna i standardburhus vid 22,5 °C ± 2,…

Representative Results

Den vakna slutna huvudskademodellen är en livskraftig metod för att inducera r-mTBI hos unga råttor. Råttor som exponerades för r-mTBI med ACHI-modellen visade inte uppenbara beteendemässiga underskott. Ämnen i dessa experiment uppvisade inte latens till höger eller apné vid någon tidpunkt under r-mTBI-proceduren, vilket indikerar att detta verkligen var en mild TBI-procedur. Subtila beteendemässiga skillnader framkom i den nationella handlingsplanen. Som beskrivits ovan poängsattes råttorna på fyra sensori…

Discussion

De flesta prekliniska undersökningar har använt modeller av mTBI som inte rekapitulerar de biomekaniska krafter som ses i den kliniska populationen. Här visas hur ACCHI-modellen kan användas för att inducera r-mTBI hos unga råttor. Denna slutna modell av r-mTBI har betydande fördelar jämfört med mer invasiva procedurer. För det första orsakar ACHI normalt inte skallfrakturer, hjärnblödningar eller dödsfall, som alla skulle vara kontraindikationer av en “mild” TBI i kliniska populationer^61<…

Materials

3D-printed helment			Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience)
Agarose	Fisher Scientific (BioReagents)	BP160500
Anesthesia chamber	Home Made	N/A	Plexiglass Container
Automatic Heater Controller	Warner Electric	TC-324B
Axon Digidata	Molecular Devices	1440A	Low-noise Data Acquisition System
Balance beam			Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride	Bio Basic Canada Inc.	CD0050	For aCSF
Camera	Dage MTI	NC-70
Carbogen tank	Praxair	MM OXCD5C-K	Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software	Molecular Devices	Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome	Precisionary	VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode	FHC Inc.	CBAPC75
Dextrose (D-Glucose)	Fisher Scientific (Chemical)	D16-3	aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier	Getting Instruments, Inc.	Model 4D
Disodium Phosphate	Fisher Scientific (Chemical)	S373-500	PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade	Electron Microscopy Sciences	72002-10
Filter Paper	Whatman 1	1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Hair Claw Clip			Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages			Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator	Quest Scientific	726300
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath	Fisher Scientific	15-462-15
Leica Impact One CCI unit	Leica Biosystems		Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male	Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad			3" polyurethane foam sheet
Magnesium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	M33-500	aCSF
Male Long Evans Rats	Charles River Laboratories		Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices	Model 700B
pH Test Strips	VWR Chemicals BDH	BDH83931.601
Potassium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	P217-500	aCSF, PBS
Potassium Phosphate	Sigma	P9791-500G	PBS
Push Button Controller	Siskiyou Corporation	MC1000e	Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs	ELITechGroup	SS-033	For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific (Chemical)	S233-500	aCSF
Sodium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	S271-3	For aCSF, PBS
Sodium Phosphate	Fisher Scientific (Chemical)	S369-500	aCSF
Soft Plastic Restraint Cones	Braintree Scientific	model DC-200
Stopwatch			Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges			For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament)	Sutter Instrument	BF150-110-10	Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope	Olympus	Olympus BX5OWI	5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer	Vapro	Model 5600	aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table	Kinetic Systems	9101-01-45