Beurteilung von Veränderungen in der synaptischen Plastizität unter Verwendung eines wachen geschlossenen Kopfverletzungsmodells für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Summary

In dieser Arbeit wird gezeigt, wie ein waches geschlossenes Kopfverletzungsmodell verwendet werden kann, um die Auswirkungen eines wiederholten leichten Schädel-Hirn-Traumas (r-mSHT) auf die synaptische Plastizität im Hippocampus zu untersuchen. Das Modell repliziert wichtige Merkmale des r-mSHT bei Patienten und wird in Verbindung mit der in vitro Elektrophysiologie eingesetzt.

Abstract

Leichtes Schädel-Hirn-Trauma (mSHT) ist ein weit verbreitetes Gesundheitsproblem in Nordamerika. Es besteht ein zunehmender Druck, ökologisch valide Modelle von mSHT mit geschlossenem Kopf im präklinischen Umfeld zu verwenden, um die Übertragbarkeit auf die klinische Bevölkerung zu erhöhen. Das ACHI-Modell (Awake Closed-Head-Injury) verwendet einen modifizierten kontrollierten kortikalen Impaktor, um eine geschlossene Kopfverletzung zu verursachen und klinisch relevante Verhaltensdefizite zu induzieren, ohne dass eine Kraniotomie oder der Einsatz eines Anästhetikums erforderlich ist.

Diese Technik führt normalerweise nicht zu Todesfällen, Schädelbrüchen oder Hirnblutungen und ist eher mit einer leichten Verletzung vereinbar. Die milde Natur des ACHI-Verfahrens macht es ideal für Studien, die repetitive mSHT (r-mSHT) untersuchen. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass r-mSHT zu einer kumulativen Verletzung führen kann, die Verhaltenssymptome, neuropathologische Veränderungen und Neurodegeneration hervorruft. r-mSHT tritt häufig bei Jugendlichen auf, die Sport treiben, und diese Verletzungen treten während einer Phase robuster synaptischer Reorganisation und Myelinisierung auf, was die jüngere Bevölkerung besonders anfällig für die langfristigen Einflüsse von r-mSHT macht.

Darüber hinaus tritt r-mSHT in Fällen von Gewalt in der Partnerschaft auf, eine Erkrankung, für die es nur wenige objektive Screening-Maßnahmen gibt. In diesen Experimenten wurde die synaptische Funktion im Hippocampus von juvenilen Ratten, die ein r-mSHT erlebt hatten, mit Hilfe des ACHI-Modells untersucht. Nach den Verletzungen wurde ein Gewebeschneider verwendet, um Hippocampusschnitte zu machen, um die bidirektionale synaptische Plastizität im Hippocampus entweder 1 oder 7 Tage nach dem r-mSHT zu bewerten. Insgesamt bietet das ACHI-Modell den Forschern ein ökologisch valides Modell, um Veränderungen der synaptischen Plastizität nach mSHT und r-mSHT zu untersuchen.

Introduction

Schädel-Hirn-Trauma (SHT) ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem, mit ~2 Millionen Fällen in Kanada und den Vereinigten Staaten pro Jahr ^1,2. SHT betrifft alle Altersgruppen und Geschlechter und hat eine höhere Inzidenzrate als jede andere Erkrankung, insbesondere Brustkrebs, AIDS, Parkinson und Multiple Sklerose³. Trotz der Prävalenz des SHT ist die Pathophysiologie nach wie vor nur unzureichend verstanden, und die Behandlungsmöglichkeiten sind begrenzt. Dies liegt zum Teil daran, dass 85 % aller SHT als mild (mSHT) eingestuft werden und bisher angenommen wurde, dass mSHT nur begrenzte und vorübergehende Verhaltensänderungen ohne neuropsychiatrische Langzeitfolgen hervorruft ^4,5. Es ist inzwischen bekannt, dass die Genesung von mSHT Wochen bis Jahre^{dauern kann 5,6,} schwerwiegendere^{neurologische} Erkrankungen auslösen kann 4 und dass selbst wiederholte “sub-erschütternde” Stöße das Gehirn beeinträchtigen⁷. Dies ist alarmierend, da Sportler in Sportarten wie Hockey/Fußball >10 sub-erschütternde Stöße pro Spiel/Trainingseinheit haben 7,8,9,10.

Jugendliche haben die höchste Inzidenz von mSHT, und in Kanada wird jährlich etwa einer von 10 Teenagern wegen einer sportbedingten Gehirnerschütterung ärztliche Hilfe in Anspruch nehmen^11,12. In der Realität kann jeder sub-erschütternde Kopfaufprall oder mSHT diffuse Schäden am Gehirn verursachen, was auch zu einem anfälligeren Zustand für nachfolgende Verletzungen und/oder schwerwiegendere neurologische Erkrankungen führen könnte 13,14,15,16,17. In Kanada ist es durch das Rowan’sche Gesetz rechtlich anerkannt, dass eine frühere Verletzung die Anfälligkeit des Gehirns für weitere Verletzungen erhöhen kann¹⁸, aber das mechanistische Verständnis von r-mSHT ist nach wie vor völlig unzureichend. Es ist jedoch klar, dass einzelne und r-mSHT die Lernfähigkeit während der Schulzeit^{beeinflussen können 19,20}, geschlechtsspezifische Ergebnisse^{haben 21,22,23,2} 4 und die kognitive Leistungsfähigkeit im späteren Leben^{beeinträchtigen können 16,25,26}. In der Tat assoziieren Kohortenanalysen r-mSHT früh im Leben stark mit einer späteren Demenz^27,28. r-mSHT ist möglicherweise auch mit chronischer traumatischer Enzephalopathie (CTE) assoziiert, die durch die Akkumulation von hyperphosphoryliertem Tau-Protein und progressiver kortikaler Atrophie gekennzeichnet ist und durch eine signifikante Entzündung ausgelöst wird 27,29,30,31. Obwohl die Zusammenhänge zwischen r-mSHT und CTE derzeit umstritten sind³², wird dieses Modell es ermöglichen, sie in einem präklinischen Umfeld genauer zu untersuchen.

Ein mSHT wird oft als “unsichtbare Verletzung” bezeichnet, da es in einem geschlossenen Schädel auftritt und selbst mit modernen bildgebenden Verfahren schwer zu erkennen ist^33,34. Ein genaues experimentelles Modell von mSHT sollte zwei Grundsätzen folgen. Zunächst sollten die biomechanischen Kräfte rekapituliert werden, die normalerweise in der klinischen Population beobachtet werden³⁵. Zweitens sollte das Modell heterogene Verhaltensergebnisse induzieren, was auch in klinischen Populationen weit verbreitet ist^36,37,38. Derzeit sind die meisten präklinischen Modelle tendenziell schwerwiegender und umfassen Kraniotomie, stereotaktische Kopfstütze, Anästhesie und kontrollierte kortikale Auswirkungen (CCI), die erhebliche strukturelle Schäden und umfangreichere Verhaltensdefizite verursachen, als normalerweise klinisch beobachtet werden³³. Ein weiteres Problem bei vielen präklinischen Modellen von Gehirnerschütterungen, die Kraniotomien beinhalten, besteht darin, dass dieses Verfahren selbst eine Entzündung im Gehirn hervorruft, was die Symptome eines mSHT und die Neuropathologie durch eine spätere Verletzung verschlimmern kann^39,40. Die Anästhesie führt auch zu mehreren komplexen Störfaktoren, darunter die Verringerung der Entzündung 41,42,43, die Modulation der Mikrogliafunktion 44, die Freisetzung von Glutamat⁴⁵, den Eintritt von Ca²⁺ durch NMDA-Rezeptoren 46^, den intrakraniellen Druck und den zerebralen Stoffwechsel ⁴⁷. Die Anästhesie führt außerdem zu Störfaktoren, indem sie die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Tau-Hyperphosphorylierung und den Kortikosteroidspiegel erhöht und gleichzeitig die kognitive Funktion verringert 48,49,50,51. Darüber hinaus machen diffuse, geschlossene Verletzungen die überwiegende Mehrheit der klinischen mSHT aus⁵². Sie ermöglichen es auch, die Vielzahl von Faktoren besser zu untersuchen, die Verhaltensergebnisse beeinflussen können, darunter Geschlecht²¹, Alter 53, Inter-Verletzungsintervall¹⁵, Schweregrad⁵⁴ und die Anzahl der Verletzungen²³.

Die Richtung der Beschleunigungs-/Verzögerungskräfte (vertikal oder horizontal) ist ebenfalls ein wichtiger Faktor für das Verhalten und die molekularen Ergebnisse. Untersuchungen von Mychasiuk und Kollegen haben zwei Modelle von diffusen mSHT mit geschlossenem Kopf verglichen: Gewichtsabfall (vertikale Kräfte) und seitlicher Aufprall (horizontale Kräfte)⁵⁵. Sowohl die Verhaltens- als auch die molekularen Analysen zeigten heterogene modell- und geschlechtsabhängige Ergebnisse nach mSHT. Tiermodelle, die helfen, chirurgische Eingriffe zu vermeiden und gleichzeitig lineare und Rotationskräfte einzubeziehen, sind daher repräsentativer für die physiologischen Bedingungen, unter denen diese Verletzungen normalerweise auftreten^33,56. Das ACHI-Modell wurde als Reaktion auf diesen Bedarf entwickelt und ermöglicht die schnelle und reproduzierbare Induktion von mSHT bei Ratten bei gleichzeitiger Vermeidung von Verfahren (d. h. Anästhesie), von denen bekannt ist, dass sie Geschlechtsunterschiede verzerren⁵⁷.

Protocol

Die Genehmigung für alle Tierverfahren wurde vom Tierpflegeausschuss der University of Victoria in Übereinstimmung mit den Standards des Canadian Council on Animal Care (CCAC) erteilt. Alle männlichen Long-Evans-Ratten wurden im eigenen Haus gezüchtet oder gekauft (siehe Materialtabelle). 1. Haltungs- und Zuchtbedingungen Lassen Sie die Tiere 1 Woche lang an ihre Haltungsumgebung gewöhnen, bevor sie am 21. Tag nach der Geburt (PND) entwöhnt wer…

Representative Results

Das Awake Closed-Head-Verletzungsmodell ist eine praktikable Methode zur Induktion von r-mSHT bei juvenilen Ratten. Ratten, die mit dem ACHI-Modell r-mSHT ausgesetzt waren, zeigten keine offensichtlichen Verhaltensdefizite. Die Probanden in diesen Experimenten zeigten zu keinem Zeitpunkt während des r-mSHT-Verfahrens eine Latenz nach rechts oder Apnoe, was darauf hindeutet, dass es sich tatsächlich um ein mildes SHT-Verfahren handelte. Im NAP zeigten sich subtile Verhaltensunterschiede; Wie oben beschrieben, wurden die…

Discussion

In den meisten präklinischen Forschungen wurden Modelle von mSHT verwendet, die die biomechanischen Kräfte, die in der klinischen Population beobachtet wurden, nicht rekapitulieren. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie das ACHI-Modell zur Induktion von r-mTBIs bei juvenilen Ratten eingesetzt werden kann. Dieses geschlossene Modell des r-mSHT hat erhebliche Vorteile gegenüber invasiveren Verfahren. Erstens verursacht das ACHI normalerweise keine Schädelfrakturen, Hirnblutungen oder Todesfälle, die alle Kontraindikation…

Materials

3D-printed helment			Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience)
Agarose	Fisher Scientific (BioReagents)	BP160500
Anesthesia chamber	Home Made	N/A	Plexiglass Container
Automatic Heater Controller	Warner Electric	TC-324B
Axon Digidata	Molecular Devices	1440A	Low-noise Data Acquisition System
Balance beam			Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride	Bio Basic Canada Inc.	CD0050	For aCSF
Camera	Dage MTI	NC-70
Carbogen tank	Praxair	MM OXCD5C-K	Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software	Molecular Devices	Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome	Precisionary	VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode	FHC Inc.	CBAPC75
Dextrose (D-Glucose)	Fisher Scientific (Chemical)	D16-3	aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier	Getting Instruments, Inc.	Model 4D
Disodium Phosphate	Fisher Scientific (Chemical)	S373-500	PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade	Electron Microscopy Sciences	72002-10
Filter Paper	Whatman 1	1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Hair Claw Clip			Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages			Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator	Quest Scientific	726300
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath	Fisher Scientific	15-462-15
Leica Impact One CCI unit	Leica Biosystems		Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male	Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad			3" polyurethane foam sheet
Magnesium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	M33-500	aCSF
Male Long Evans Rats	Charles River Laboratories		Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices	Model 700B
pH Test Strips	VWR Chemicals BDH	BDH83931.601
Potassium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	P217-500	aCSF, PBS
Potassium Phosphate	Sigma	P9791-500G	PBS
Push Button Controller	Siskiyou Corporation	MC1000e	Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs	ELITechGroup	SS-033	For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific (Chemical)	S233-500	aCSF
Sodium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	S271-3	For aCSF, PBS
Sodium Phosphate	Fisher Scientific (Chemical)	S369-500	aCSF
Soft Plastic Restraint Cones	Braintree Scientific	model DC-200
Stopwatch			Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges			For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament)	Sutter Instrument	BF150-110-10	Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope	Olympus	Olympus BX5OWI	5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer	Vapro	Model 5600	aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table	Kinetic Systems	9101-01-45