Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans
Summary
Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.
Abstract
De samenstelling van het darmmicrobioom kan een dramatische invloed hebben op de fysiologie van de gastheer tijdens de ontwikkeling en het leven van het dier. Het meten van veranderingen in de samenstelling van het microbioom is cruciaal bij het identificeren van de functionele relaties tussen deze fysiologische veranderingen. Caenorhabditis elegans is naar voren gekomen als een krachtig gastheersysteem om de moleculaire drijfveren van gastheer-microbioominteracties te onderzoeken. Met zijn transparante lichaamsplan en fluorescerend gelabelde natuurlijke microben kunnen de relatieve niveaus van microben in het darmmicrobioom van een individueel C. elegans-dier gemakkelijk worden gekwantificeerd met behulp van een grote deeltjessorteerder. Hier beschrijven we de procedures voor het experimenteel opzetten van een microbioom, het verzamelen en analyseren van C. elegans-populaties in de gewenste levensfase, de werking en het onderhoud van de sorteerder, en statistische analyses van de resulterende datasets. We bespreken ook overwegingen voor het optimaliseren van sorteerinstellingen op basis van de microben die van belang zijn, de ontwikkeling van effectieve poortstrategieën voor de levensfasen van C. elegans en hoe sorteermogelijkheden kunnen worden gebruikt om dierpopulaties te verrijken op basis van de samenstelling van het darmmicrobioom. Voorbeelden van mogelijke toepassingen zullen worden gepresenteerd als onderdeel van het protocol, waaronder het potentieel voor schaalbaarheid naar toepassingen met een hoge doorvoer.
Introduction
De evolutie van dieren staat onder constante microbiële invloed1. Van diverse microben in de omgeving verwerven dierlijke gastheren specifieke partners2 die de mogelijkheden van de gastheer uitbreiden en zijn fysiologie en vatbaarheid voor ziekten stimuleren3. Metagenomische analyses van het darmmicrobioom brachten bijvoorbeeld verrijkte metabole klassen van microbiële genen aan het licht die een grotere energieoogst en -opslag kunnen opleveren bij zwaarlijvige muizen4, waarvan er vele ook worden aangetroffen in het menselijke darmmicrobioom5. Er is nog steeds een grote behoefte om causale verbanden vast te stellen en de moleculaire determinanten van de impact van het microbioom vast te stellen, hoewel de vooruitgang wordt belemmerd door de complexiteit van het microbioom en de traceerbaarheid van gastheersystemen voor grootschalige screening.
Het modelorganisme C. elegans biedt een platform om het moleculaire begrip van verbanden tussen microbioom en gastheerfysiologie te bevorderen. C. elegans bezit 20 darmcellen met een slijmvlieslaag en villistructuren. Deze cellen zijn uitgerust met overvloedige chemoreceptorgenen die microbiële producten detecteren en antimicrobiële moleculen produceren die mogelijk hun darmkolonisatoren reguleren 6,7. Deze geconserveerde biologie van C. elegans heeft geleid tot een enorm aantal ontdekkingen in gastheersignalering die darmmicroben reguleren, waaronder insulinesignalering, TGF-bèta en MAP-kinase 8,9,10.
C. elegans gebruiken microben als zowel hun dieet voor groei tijdens de ontwikkeling als het microbioom als volwassenen. Naarmate ouder worden, kunnen sommige microben zich te veel ophopen in het darmlumen en verschuift de relatie tussen gastheer en microbe van symbiose naar pathogenese11. In hun natuurlijke habitat komt C. elegans een breed scala aan bacteriesoorten tegen12,13. Sequencing van 16S rDNA van representatieve monsters verzameld in natuurlijke habitats (rot fruit, plantenstengel en dierlijke vectoren) onthulde dat het natuurlijke microbioom van C. elegans wordt gedomineerd door vier bacteriële phyla: Proteobacteriën, Bacteroidetes, Firmicutes pt Actinobacteriën. Binnen deze divisies ligt een grote variatie in de diversiteit en rijkdom van bacteriën op basis van de habitat12,13,14,15. Er zijn verschillende gedefinieerde gemeenschappen opgericht, waaronder de 63-leden (BIGbiome)16 en 12-leden (CeMbio) collecties die de belangrijkste microbioomgeslachten vertegenwoordigen die zijn gecreëerd voor de C. elegans-onderzoeksgemeenschap 17. Zowel microbiomen als samenstellende stammen kunnen een diverse invloed hebben op de fysiologie van C. elegans, zoals lichaamsgrootte, groeisnelheid en stressreacties9,16,17. Deze studies bieden middelen en voorbeelden om C. elegans vast te stellen als een model voor microbioomonderzoek.
Hier wordt een op grote deeltjessorteerder (LPS) gebaseerde workflow (Figuur 1) gepresenteerd die gebruik maakt van het C. elegans-systeem om tegelijkertijd de samenstelling van het microbioom en basismetingen van de fysiologie van de gastheer op populatieschaal te meten. Aan de microbiële kant is de workflow aanpasbaar om een gedefinieerd microbioom of enkele microben samen te stellen om de robuustheid en plasticiteit van de gemeenschap te testen met toenemende microbiële interacties. Aan de kant van de gastheer maakt de workflow high-throughput-assays mogelijk om kolonisatieniveaus van fluorescerende microben in het microbioom te meten en de fysiologische uitlezing van de gastheer in termen van ontwikkeling, lichaamsgrootte en reproductie. Alles bij elkaar maakt het microbioommodel van C. elegans high-throughput screens mogelijk om de metabole en genetische determinanten te lokaliseren die de fysiologie van de gastheer moduleren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flowvermimetrie is gebruikt om C. elegans-genen en -routes tegen pathogene kolonisatie en toxiciteit in verschillende onderzoeken te karakteriseren21,22. Hier wordt een ‘high throughput alife’ benadering gepresenteerd die C. elegans gebruikt om te onderzoeken hoe darmmicrobiomen hun gastheerfysiologie moduleren. Vergeleken met bestaande methoden die gebruik maken van kolonievormende eenheden (CFU) of 16S rRNA-ampliconsequencing 9,16,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies DP2DK116645 (aan BSS), Dunn Foundation pilot award en NASA-subsidie 80NSSC22K0250 (aan BSS). Dit project werd ook ondersteund door de Cytometry and Cell Sorting Core van het Baylor College of Medicine met financiering van de CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), de NIH (S10 OD025251, CA125123 en RR024574), en de hulp van Joel M. Sederstrom, plus een instrumentatiesubsidie voor de LPS NIH-subsidie (S10 OD025251). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Referências
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
- Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
- Wickham, H., et al. . tidyverse. , (2019).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
- Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
- Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877 (2018).
- Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
- Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genética. 207 (2), 447-463 (2017).
