Applicazione della vermimetria a flusso per la quantificazione e l'analisi del microbioma intestinale di Caenorhabditis elegans
Summary
Caenorhabditis elegans è un potente modello per esaminare i determinanti molecolari che guidano le interazioni ospite-microbioma. Presentiamo una pipeline ad alto rendimento che profila i livelli di colonizzazione del microbioma intestinale dei singoli animali insieme ad aspetti chiave della fisiologia di C. elegans.
Abstract
La composizione del microbioma intestinale può avere un impatto drammatico sulla fisiologia dell’ospite durante lo sviluppo e la vita dell’animale. Misurare i cambiamenti di composizione nel microbioma è fondamentale per identificare le relazioni funzionali tra questi cambiamenti fisiologici. Caenorhabditis elegans è emerso come un potente sistema ospite per esaminare i driver molecolari delle interazioni ospite-microbioma. Con la sua pianta corporea trasparente e i microbi naturali marcati con fluorescenza, i livelli relativi di microbi all’interno del microbioma intestinale di un singolo animale di C. elegans possono essere facilmente quantificati utilizzando un grande selezionatore di particelle. Qui descriviamo le procedure per l’impostazione sperimentale di un microbioma, la raccolta e l’analisi delle popolazioni di C. elegans nella fase di vita desiderata, il funzionamento e la manutenzione del selezionatore e le analisi statistiche dei set di dati risultanti. Discutiamo anche le considerazioni per l’ottimizzazione delle impostazioni del selezionatore in base ai microbi di interesse, lo sviluppo di strategie di gating efficaci per le fasi di vita di C. elegans e come utilizzare le capacità del selezionatore per arricchire le popolazioni animali in base alla composizione del microbioma intestinale. Esempi di potenziali applicazioni saranno presentati come parte del protocollo, incluso il potenziale di scalabilità per applicazioni ad alto throughput.
Introduction
L’evoluzione animale è sotto costante influenza microbica1. Da diversi microbi presenti nell’ambiente, gli ospiti animali acquisiscono partner specifici2 che estendono le capacità dell’ospite e guidano la sua fisiologia e suscettibilità alle malattie3. Ad esempio, le analisi metagenomiche del microbioma intestinale hanno scoperto classi metaboliche arricchite di geni microbici che possono conferire una maggiore raccolta e immagazzinamento di energia nei topi obesi4, molti dei quali si trovano anche nel microbioma intestinale umano5. C’è ancora un grande bisogno di stabilire relazioni causali e individuare i determinanti molecolari dell’impatto del microbioma, anche se i progressi sono stati ostacolati dalle complessità del microbioma e dalla trattabilità dei sistemi ospiti per lo screening su larga scala.
L’organismo modello C. elegans fornisce una piattaforma per far progredire la comprensione molecolare dei legami tra microbioma e fisiologia dell’ospite. C. elegans possiede 20 cellule intestinali con uno strato mucoso e strutture di villi. Queste cellule sono dotate di abbondanti geni chemorecettori che rilevano i prodotti microbici e producono molecole antimicrobiche che potenzialmente regolano i loro colonizzatori intestinali 6,7. Questa biologia conservata di C. elegans ha portato a un numero enorme di scoperte nella segnalazione dell’ospite che regola i microbi intestinali, tra cui la segnalazione dell’insulina, il TGF-beta e la MAP chinasi 8,9,10.
C. elegans utilizza i microbi sia come dieta per la crescita durante lo sviluppo che come microbioma da adulti. Con l’avanzare dell’età, alcuni microbi possono accumularsi eccessivamente nel lume intestinale e la relazione ospite-microbo si sposta dalla simbiosi alla patogenesi11. Nel suo habitat naturale, C. elegans incontra una vasta gamma di specie batteriche12,13. Il sequenziamento dell’rDNA 16S da campioni rappresentativi raccolti in habitat naturali (frutti marci, fusto vegetale e vettori animali) ha rivelato che il microbioma naturale di C. elegans è dominato da quattro phyla batterici: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacteria. All’interno di queste divisioni si trova una grande variazione nella diversità e nella ricchezza dei batteri in base all’habitat12,13,14,15. Sono state istituite diverse comunità definite, tra cui le collezioni di 63 membri (BIGbiome)16 e 12 membri (CeMbio) che rappresentano i principali generi di microbioma creati per la comunità di ricerca di C. elegans 17. Sia i microbiomi che i ceppi componenti possono avere un impatto diverso sulla fisiologia di C. elegans, come le dimensioni corporee, i tassi di crescita e le risposte allo stress 9,16,17. Questi studi forniscono risorse ed esempi per stabilire C. elegans come modello per la ricerca sul microbioma.
Qui viene presentato un flusso di lavoro basato su Large Particle Sorter (LPS) (Figura 1) che utilizza il sistema C. elegans per misurare simultaneamente la composizione del microbioma e le misure di base della fisiologia dell’ospite su scala di popolazione. Dal punto di vista microbico, il flusso di lavoro è adattabile per assemblare un microbioma definito o singoli microbi per testare la robustezza e la plasticità della comunità con interazioni microbiche crescenti. Dal punto di vista dell’ospite, il flusso di lavoro consente saggi ad alto rendimento per misurare i livelli di colonizzazione dei microbi fluorescenti nel microbioma e la lettura fisiologica dell’ospite in termini di sviluppo, dimensioni corporee e riproduzione. Nel complesso, il modello di microbioma di C. elegans consente di individuare i determinanti metabolici e genetici che modulano la fisiologia dell’ospite.
Protocol
Representative Results
Discussion
La vermimetria a flusso è stata utilizzata per caratterizzare i geni e le vie di C. elegans contro la colonizzazione e la tossicità dei patogeni in diversi studi21,22. Qui, viene presentato un approccio ad alto rendimento che utilizza C. elegans per studiare come i microbiomi intestinali modulano la fisiologia dell’ospite. Rispetto ai metodi esistenti che utilizzano unità formanti colonie (CFU) o il sequenziamento dell’amplicone dell’rRNA 16S…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH DP2DK116645 (a BSS), dal premio pilota della Fondazione Dunn e dalla sovvenzione NASA 80NSSC22K0250 (a BSS). Questo progetto è stato anche sostenuto dal Cytometry and Cell Sorting Core presso il Baylor College of Medicine con il finanziamento del CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), del NIH (S10 OD025251, CA125123 e RR024574) e l’assistenza di Joel M. Sederstrom, oltre a una sovvenzione per la strumentazione per la sovvenzione LPS NIH (S10 OD025251). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall’Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Referências
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