Testing av kreftimmunterapi i en humanisert musemodell som bærer menneskelige svulster

Summary

Denne protokollen skisserer genereringen av mus av humant immunsystem (HIS) for immunonkologistudier. Instruksjoner og betraktninger i bruken av denne modellen for testing av humane immunterapier på humane svulster implantert i denne modellen presenteres med vekt på å karakterisere responsen av det humane immunsystemet til svulsten.

Abstract

Reversering av den immunosuppressive naturen til tumormikromiljøet er kritisk for vellykket behandling av kreft med immunterapimedisiner. Murine kreftmodeller er ekstremt begrenset i sitt mangfold og lider av dårlig oversettelse til klinikken. For å tjene som en mer fysiologisk preklinisk modell for immunterapistudier, har denne protokollen blitt utviklet for å evaluere behandlingen av humane svulster i en mus rekonstituert med et humant immunsystem. Denne unike protokollen demonstrerer utviklingen av humant immunsystem (HIS, “humanisert”) mus, etterfulgt av implantasjon av en human tumor, enten en cellelinjeavledet xenograft (CDX) eller en pasientavledet xenograft (PDX). HIS mus genereres ved å injisere CD34+ humane hematopoietiske stamceller isolert fra navlestrengsblod inn i neonatale BRGS (BALB / c Rag2-/- IL2RγC-^/- NOD ^SIRPα) svært immundefekte mus som også er i stand til å akseptere en xenogen tumor. Betydningen av kinetikken og egenskapene til det menneskelige immunsystemutviklingen og tumorimplantasjonen understrekes. Til slutt beskrives en grundig evaluering av tumormikromiljøet ved hjelp av flowcytometri. I mange studier ved bruk av denne protokollen ble det funnet at tumormikromiljøet til individuelle svulster rekapituleres i HIS-PDX-mus; “Varme” svulster utviser stor immuninfiltrasjon, mens “kalde” svulster ikke gjør det. Denne modellen fungerer som et testområde for kombinasjonsimmunterapier for et bredt spekter av humane svulster og representerer et viktig verktøy i jakten på personlig medisin.

Introduction

Musekreftmodeller er viktige for å etablere grunnleggende mekanismer for tumorvekst og immunflukt. Imidlertid har kreftbehandlingsstudier i musemodeller gitt endelig oversettelse til klinikken på grunn av begrensede syngene modeller og artsspesifikke forskjeller ^1,2. Fremveksten av immunterapier som en dominerende tilnærming til å kontrollere svulster har gjentatt behovet for en in vivo-modell med et funksjonelt humant immunsystem. Fremskritt i humane immunsystemmus (HIS mus) i løpet av det siste tiåret har gjort det mulig å studere immunonkologi in vivo i et bredt spekter av krefttyper og immunterapeutiske midler 3,4,5,6. Humane tumormodeller, inkludert cellelinjeavledede og pasientavledede xenotransplantater (henholdsvis CDX og PDX), vokser godt i HES-mus og er i de fleste tilfeller nesten identiske med veksten i den immundefekte verten som mangler human hematopoietisk engraftment ^7,8. Basert på dette nøkkelfunnet har forskere brukt HIS-musemodellen til å studere humane immunterapier, inkludert kombinasjonsterapier designet for å endre tumormikromiljøet (TME) for å redusere immunsuppresjon og dermed forbedre immunrettet tumordrap. Disse prekliniske modellene bidrar til å løse problemene med heterogenitet av humane kreftformer, og kan også forutsi behandlingssuksess, samt overvåke immunrelaterte legemiddeltoksisiteter ^9,10.

Produksjonen av en musemodell med et humant immunsystem gjennom innføring av humane hematopoietiske stamceller krever en mottakerimmundefekt mus som ikke vil avvise xenograft. Nåværende HIS musemodeller er avledet fra immundefekte musestammer som ble rapportert for over 30 år siden. Den første immundefekte musestammen som ble beskrevet var SCID-mus som manglet T- og B-celler¹¹, etterfulgt av en hybrid NOD-SCID med en SIRPα-polymorfisme som var ansvarlig for musemakrofagtoleranse for humane celler, på grunn av økt binding for NOD SIRPα-allelen til det humane CD47-molekylet^12,13. På begynnelsen av 2000-tallet var slettingen av den vanlige gammakjeden til IL-2-reseptoren (IL-2Rγc) på både BALB / c og NOD immundefekte stammer en spillveksler for forbedret menneskelig engraftment, på grunn av genetiske delesjoner som forbyr vert NK-celleutvikling^14,15,16,17. Alternative modeller, som BRG- og NRG-mus, oppnår T- og B-cellemangel gjennom delesjon av Rag1– eller Rag2-genet, som kreves for T- og B-cellereseptorgenomorganiseringer og dermed modning og overlevelse av lymfocytter^18,19. BRGS (BALB / c -Rag2 null Il2R γC^nullSirpα^NOD) mus som brukes her kombinerer IL-2Rγ kjedemangel og NOD SIRPα allel påRag2-/- bakgrunnen, noe som resulterer i en svært immundefekt mus uten T-, B- eller NK-celler, men med tilstrekkelig kraft og helse til å tillate langsiktig engraftment på mer enn 30 uker¹³.

HIS mus kan genereres på flere måter, med human PBMC-injeksjon som den mest direkte metoden^15,18,20. Imidlertid har disse musene en uttalt utvidelse av aktiverte humane T-celler som resulterer i graft versus host disease (GVHD) ved 12 ukers alder, og forhindrer langsiktige studier. Alternativt kan humane hematopoietiske stamceller fra navlestrengsblod (CB), benmarg og fosterlever også brukes til engraftment og produksjon av det humane immunsystemet de novo. I dette systemet produserer de hematopoietiske stamcellene et humant immunsystem med flere linjer med generering av T, B og medfødte immunceller som er viktig tolerante for museverten, sammenlignet med PBMC-musene som hovedsakelig utvikler T-celler. Derfor er GVHD fraværende eller sterkt forsinket, og studier kan utvides til mus opp til 10 måneder. CB gir en enkel, tilgjengelig og ikke-invasiv kilde til CD34 + humane hematopoietiske stamceller som letter engraftment av flere HIS-mus med genetisk identiske immunsystemer 17,18,20,21. I løpet av de siste årene har HIS musemodeller blitt brukt mye for å studere immunterapi og TME 3,4,5,6. Til tross for utviklingen av humant avledet immunsystem i disse musene, vokser humane xenografttumorer med tilsvarende hastigheter sammenlignet med kontrollimmundefektmusene og tillater det komplekse samspillet mellom kreftcellene og immuncellene, noe som er viktig for å opprettholde mikromiljøet til den transplanterte PDX ^3,7,8 . Denne protokollen har blitt brukt til å utføre over 50 studier som tester behandlinger i HIS-BRGS-mus med PDX og CDX. En viktig konklusjon er at humane svulster i HIS-musene opprettholder sin unike TME som definert ved molekylær evaluering av svulsten i forhold til den første pasientprøven og immuninfiltrategenskapene 3,22,23. Vår gruppe fokuserer på dybdeevaluering av HIS i både immunorganer og svulst ved hjelp av multiparameter flowcytometri. Her beskriver vi en protokoll for humanisering av BRGS-mus, evaluering av kimerisme, implantasjon av humane svulster, tumorvekstmålinger, kreftbehandlingsadministrasjon og analyse av HIS-cellene ved flowcytometri.

Protocol

Alt dyrearbeid ble utført under dyreprotokoller godkjent av University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC protokoller #00593 og #00021). Alt dyrearbeid ble utført i samsvar med Office of Laboratory Animal Resources (OLAR), et akkreditert anlegg av American Association for Laboratory Animal Care, ved University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus. Alle navlestrengsblodprøver fra mennesker ble innhentet som donasjoner fra avidentifiserte givere og er derfor ikke underlagt godkje…

Representative Results

Etter flanketumorprotokollen og eksperimentell tidslinje (figur 1) ble tumorvekst og immunrespons på en målrettet tyrosinkinasehemmer (TKI) terapi og nivolumab kombinasjonsbehandling studert i to distinkte humane kolorektal kreft (CRC) PDX. TKI-legemidlene har blitt studert i immundefekte verter for å evaluere tumorvekst bare29. Denne modellen muliggjorde studiet av endringer i immunresponsen til TKI alene, og enda viktigere, i kombinasjon med anti-PD-1. Denne stud…

Discussion

I løpet av de siste 6 årene, ved hjelp av vår kompetanse innen både immunologi og humaniserte mus, har vårt forskerteam utviklet en sårt tiltrengt preklinisk modell for å teste immunterapier på en rekke humane svulster 3,7,30,31. Denne protokollen legger vekt på hensynet til modellens variabilitet, med spesiell oppmerksomhet til immunterapi-sentriske humane T-cellepopulasjoner. I denne…

Materials

1 mL syringe w/needles	McKesson	1031815
15 mL tubes	Grenier Bio-One	188271
2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
50 mL tubes	Grenier Bio-One	227261
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi	130-092-545
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin	BD Bioscience	BDB563792
BSA	Fisher Scientific	BP1600100
Cell Stim Cocktail	Life Technologies	509305
Chill 15 Rack	Miltenyi	130-092-952
Cotton-plugged glass pipettes	Fisher Scientific	13-678-8B
Cultrex Basement membrane extract	R&D Systems	363200502
Cytek Aurora	Cytek
DNase	Sigma	9003-98-9
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00
Embryonic Stemcell FCS	Gibco	10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume	Grenier Bio-One	616201
Excel	Microsoft
FBS	Benchmark	100-106 500mL
Ficoll Hypaque	GE Healthcare	45001752
FlowJo Software	BD Biosciences
Forceps – fine	Roboz Surgical	RS5045
Forceps normal	Dumont	RS4919
Formaldehyde	Fisher	F75P1GAL
Frosted Glass Slides	Corning	1255310
Gentlemacs C-Tubes	Miltenyi	130-096-334
GentleMACS Dissociator	Miltenyi	130-093-235
glass pipettes	DWK Life Sciences	63A53
Glutamax	Gibco	11140050
HBSS w/ Ca & Mg	Sigma	55037C
HEPES	Corning	MT25060CI
IgG standard	Sigma	I2511
IgM standard	Sigma	401108
IMDM	Gibco	12440053
Liberase DL	Roche	5466202001
LIVE/DEAD Fixable Blue	Thermo	L23105
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
MEM	Gibco	1140050
mouse anti-human IgG-AP	Southern Biotech	JDC-10
mouse anti-human IgG-unabeled	Southern Biotech	H2
mouse anti-human IgM-AP	Southern Biotech	UHB
mouse anti-human IgM-unlabeled	Southern Biotech	SA-DA4
MultiRad 350	Precision X-Ray
PBS	Corning	45000-446
Pen Strep	Gibco	15140122
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875713A
p-nitrophenyl substrate	Thermo	34045
PRISM	Graphpad
Rec Hu FLT3L	R&D systems	308-FK-005/CF
Rec Hu IL6	R&D systems	206-IL-010/CF
Rec Hu SCF	R&D systems	255SC010
RPMI 1640	Corning	45000-39
Saponin	Sigma	8047-15-2
Scissors	McKesson	862945
Serological pipettes 25 mL	Fisher Scientific	1367811
Sterile filter	Nalgene	567-0020
Sterile molecular water	Sigma	7732-18-5
Yeti Cell Analyzer	Bio-Rad	12004279
Zombie Green	biolegend	423112