Prueba de inmunoterapia contra el cáncer en un modelo de ratón humanizado con tumores humanos
Summary
Este protocolo describe la generación de ratones del sistema inmune humano (HIS) para estudios de inmunooncología. Las instrucciones y consideraciones en el uso de este modelo para probar inmunoterapias humanas en tumores humanos implantados en este modelo se presentan con énfasis en la caracterización de la respuesta del sistema inmune humano al tumor.
Abstract
Revertir la naturaleza inmunosupresora del microambiente tumoral es fundamental para el tratamiento exitoso de los cánceres con medicamentos de inmunoterapia. Los modelos de cáncer murino son extremadamente limitados en su diversidad y sufren de una mala traducción a la clínica. Para servir como un modelo preclínico más fisiológico para estudios de inmunoterapia, este protocolo se ha desarrollado para evaluar el tratamiento de tumores humanos en un ratón reconstituido con un sistema inmune humano. Este protocolo único demuestra el desarrollo de ratones del sistema inmune humano (HIS, “humanizados”), seguido de la implantación de un tumor humano, ya sea un xenoinjerto derivado de la línea celular (CDX) o un xenoinjerto derivado del paciente (PDX). Los ratones HIS se generan inyectando células madre hematopoyéticas humanas CD34 + aisladas de la sangre del cordón umbilical en ratones BRGS neonatales (BALB / c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) altamente inmunodeficientes que también son capaces de aceptar un tumor xenogénico. Se enfatiza la importancia de la cinética y las características del desarrollo del sistema inmune humano y la implantación del tumor. Finalmente, se describe una evaluación en profundidad del microambiente tumoral mediante citometría de flujo. En numerosos estudios que utilizaron este protocolo, se encontró que el microambiente tumoral de tumores individuales se recapitula en ratones HIS-PDX; Los tumores “calientes” exhiben una gran infiltración inmune, mientras que los tumores “fríos” no lo hacen. Este modelo sirve como campo de pruebas para inmunoterapias combinadas para una amplia gama de tumores humanos y representa una herramienta importante en la búsqueda de la medicina personalizada.
Introduction
Los modelos de cáncer de ratón son importantes para establecer mecanismos básicos de crecimiento tumoral y escape inmune. Sin embargo, los estudios de tratamiento del cáncer en modelos de ratón han producido una traducción finita a la clínica debido a los modelos singénicos limitados y las diferencias específicas de la especie 1,2. La aparición de inmunoterapias como un enfoque dominante para controlar los tumores ha reiterado la necesidad de un modelo in vivo con un sistema inmune humano funcional. Los avances en ratones del sistema inmune humano (ratones HIS) durante la última década han hecho posible estudiar inmunooncología in vivo en una amplia variedad de tipos de cáncer y agentes inmunoterapéuticos 3,4,5,6. Los modelos tumorales humanos, incluidos los xenoinjertos derivados de líneas celulares y derivados de pacientes (CDX y PDX, respectivamente), crecen bien en ratones HIS y en la mayoría de los casos son casi idénticos a su crecimiento en el huésped inmunodeficiente que carece de injerto hematopoyético humano 7,8. Con base en este hallazgo clave, los investigadores han estado utilizando el modelo de ratón HIS para estudiar inmunoterapias humanas, incluidas las terapias combinadas diseñadas para alterar el microambiente tumoral (TME) para disminuir la inmunosupresión y, por lo tanto, mejorar la destrucción tumoral dirigida por el sistema inmunitario. Estos modelos preclínicos ayudan a abordar los problemas de heterogeneidad de los cánceres humanos, y también pueden predecir el éxito del tratamiento, así como monitorear las toxicidades de los medicamentos relacionados con el sistema inmunitario 9,10.
La producción de un modelo de ratón con un sistema inmune humano mediante la introducción de células madre hematopoyéticas humanas requiere un ratón inmunodeficiente receptor que no rechace el xenoinjerto. Los modelos actuales de ratón HIS se derivan de cepas de ratón inmunodeficientes que se informaron hace más de 30 años. La primera cepa de ratón inmunodeficiente descrita fueron ratones SCID que carecían de células T y B11, seguidos de un híbrido NOD-SCID con un polimorfismo SIRPα responsable de la tolerancia de los macrófagos de ratón a las células humanas, debido al aumento de la unión del alelo NOD SIRPα a la molécula CD47 humana12,13. A principios de la década de 2000, la deleción de la cadena gamma común del receptor de IL-2 (IL-2Rγc) en cepas inmunodeficientes BALB/c y NOD fue un cambio de juego para el injerto humano mejorado, debido a las deleciones genéticas que prohíben el desarrollo de células NK huésped14,15,16,17. Modelos alternativos, como ratones BRG y NRG, logran deficiencia de células T y B a través de la deleción del gen Rag1 o Rag2, requerido para los reordenamientos de los genes receptores de células T y B y, por lo tanto, la maduración y supervivencia de los linfocitos18,19. El ratón BRGS (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) utilizado aquí combina la deficiencia de la cadena IL-2Rγ y el aleloNOD SIRPα en el fondo Rag2-/-, lo que resulta en un ratón altamente inmunodeficiente sin células T, B o NK, pero con suficiente vigor y salud para permitir un injerto a largo plazo de más de 30 semanas13.
Los ratones HIS se pueden generar de múltiples maneras, siendo la inyección humana de PBMC el método más directo15,18,20. Sin embargo, estos ratones tienen una expansión pronunciada de células T humanas activadas que resulta en la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) a las 12 semanas de edad, lo que impide estudios a largo plazo. Alternativamente, las células madre hematopoyéticas humanas de la sangre del cordón umbilical (CB), la médula ósea y el hígado fetal también se pueden usar para el injerto y la producción del sistema inmunológico humano de novo. En este sistema, las células madre hematopoyéticas producen un sistema inmune humano de múltiples linajes con la generación de células T, B e inmunitarias innatas que son significativamente tolerantes al huésped del ratón, en comparación con los ratones PBMC que desarrollan principalmente células T. Por lo tanto, la EICH está ausente o muy retrasada, y los estudios pueden extenderse a ratones de hasta 10 meses de edad. CB proporciona una fuente fácil, accesible y no invasiva de células madre hematopoyéticas humanas CD34+ que facilita el injerto de múltiples ratones HIS con sistemas inmunes genéticamente idénticos 17,18,20,21. En los últimos años, los modelos de ratón HIS se han utilizado ampliamente para estudiar la inmunoterapia y el TME 3,4,5,6. A pesar del desarrollo de sistemas inmunes derivados humanos en estos ratones, los tumores de xenoinjerto humano crecen a tasas similares en comparación con los ratones inmunodeficientes de control y permiten la compleja interacción entre las células cancerosas y las células inmunes, lo cual es importante para mantener el microambiente del PDX injertado 3,7,8 . Este protocolo se ha utilizado para realizar más de 50 estudios que prueban tratamientos en ratones HIS-BRGS con PDX y CDX. Una conclusión importante es que los tumores humanos en los ratones HIS mantienen su TME único definido por la evaluación molecular del tumor en relación con la muestra inicial del paciente y las características del infiltrado inmune 3,22,23. Nuestro grupo se centra en la evaluación en profundidad del HIS tanto en los órganos inmunes como en el tumor mediante citometría de flujo multiparamétrica. Aquí, describimos un protocolo para la humanización de ratones BRGS, evaluación de quimerismo, implantación de tumores humanos, mediciones de crecimiento tumoral, administración de tratamiento del cáncer y análisis de las células HIS por citometría de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En los últimos 6 años, utilizando nuestra experiencia tanto en inmunología como en ratones humanizados, nuestro equipo de investigación ha desarrollado un modelo preclínico muy necesario para probar inmunoterapias en una variedad de tumores humanos 3,7,30,31. Este protocolo enfatiza la consideración de la variabilidad del modelo, con especial atención a las poblaciones de células T huma…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer tanto al Centro de Investigación Animal (OLAR) por su cuidado de nuestros ratones, como al Recurso Compartido de Citometría de Flujo apoyado por la Subvención de Apoyo al Centro de Cáncer (P30CA046934) en nuestro instituto por su inmensa ayuda en todo nuestro trabajo. También agradecemos tanto a Gail Eckhardt como a Anna Capasso por nuestras colaboraciones inaugurales en el estudio de inmunoterapias para PDX humanos en nuestro modelo HIS-BRGS. Este estudio fue apoyado en parte por la Subvención de Apoyo al Centro de Cáncer P30CA06934 de los Institutos Nacionales de Salud con el uso del recurso compartido PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models), RRID: SCR_021990 y Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Esta investigación fue apoyada en parte por el NIAID de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de contrato 75N93020C00058.
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
Referências
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
- Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
- Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
- Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
- Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
- Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
- Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
- Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
- Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
- Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
- Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
- Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
- Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
- Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
- Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
- Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
- Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
- Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
- Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
- Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
- Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
- Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
- Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
- Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).
