İnsan Tümörleri Taşıyan İnsanlaştırılmış Bir Fare Modelinde Kanser İmmünoterapötiklerinin Test Edilmesi
Summary
Bu protokol, immüno-onkoloji çalışmaları için insan bağışıklık sistemi (HIS) farelerinin neslini özetlemektedir. Bu modelde implante edilen insan tümörleri üzerinde insan immünoterapötiklerini test etmek için bu modelin kullanımındaki talimatlar ve hususlar, insan bağışıklık sisteminin tümöre tepkisini karakterize etmeye vurgu yapılarak sunulmuştur.
Abstract
Tümör mikroçevresinin immünsüpresif doğasının tersine çevrilmesi, immünoterapi ilaçları ile kanserlerin başarılı tedavisi için kritik öneme sahiptir. Murin kanseri modelleri çeşitliliklerinde son derece sınırlıdır ve kliniğe kötü çeviriden muzdariptir. İmmünoterapi çalışmaları için daha fizyolojik bir preklinik model olarak hizmet etmek için, bu protokol, bir insan bağışıklık sistemi ile yeniden oluşturulmuş bir farede insan tümörlerinin tedavisini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bu eşsiz protokol, insan bağışıklık sistemi (HIS, “insancıllaştırılmış”) farelerin gelişimini, ardından hücre hattından türetilmiş bir ksenograft (CDX) veya hasta kaynaklı bir ksenogreft (PDX) olmak üzere bir insan tümörünün implantasyonunu göstermektedir. HIS fareleri, göbek kordon kanından izole edilen CD34 + insan hematopoetik kök hücrelerinin, ksenojenik bir tümörü de kabul edebilen yüksek immün yetmezlikli farelere yenidoğan BRGS’ye (BALB / c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) enjekte edilmesiyle üretilir. İnsan bağışıklık sistemi gelişiminin ve tümör implantasyonunun kinetiğinin ve özelliklerinin önemi vurgulanmaktadır. Son olarak, akış sitometrisi kullanılarak tümör mikroçevresinin derinlemesine bir değerlendirmesi açıklanmaktadır. Bu protokolü kullanan çok sayıda çalışmada, bireysel tümörlerin tümör mikroçevresinin HIS-PDX farelerde özetlendiği bulunmuştur; “Sıcak” tümörler büyük bağışıklık infiltrasyonu sergilerken, “soğuk” tümörler bunu yapmaz. Bu model, çok çeşitli insan tümörleri için kombinasyon immünoterapileri için bir test alanı görevi görür ve kişiselleştirilmiş tıp arayışında önemli bir aracı temsil eder.
Introduction
Fare kanseri modelleri, tümör büyümesinin ve immün kaçışın temel mekanizmalarını oluşturmak için önemlidir. Bununla birlikte, fare modellerinde yapılan kanser tedavisi çalışmaları, sınırlı sinjenik modeller ve türe özgü farklılıklar nedeniyle kliniğe sonlu çeviri sağlamıştır 1,2. İmmün tedavilerin tümörleri kontrol etmek için baskın bir yaklaşım olarak ortaya çıkması, fonksiyonel bir insan bağışıklık sistemine sahip in vivo bir modele olan ihtiyacı yinelemiştir. Son on yılda insan bağışıklık sistemi farelerinde (HIS fareleri) meydana gelen ilerlemeler, immüno-onkolojiyi in vivo olarak çok çeşitli kanser türlerinde ve immünoterapötik ajanlarda incelemeyi mümkün kılmıştır 3,4,5,6. Hücre hattı kaynaklı ve hasta kaynaklı ksenogreftler (sırasıyla CDX ve PDX) dahil olmak üzere insan tümör modelleri, HIS farelerinde iyi büyür ve çoğu durumda, insan hematopoetik engraftmanı olmayan immün yetmezlikli konakçıdaki büyümeleriyle neredeyse aynıdır 7,8. Bu önemli bulguya dayanarak, araştırmacılar, immünsüpresyonu azaltmak ve böylece bağışıklık yönelimli tümör öldürmeyi arttırmak için tümör mikroçevresini (TME) değiştirmek için tasarlanmış kombinasyon terapileri de dahil olmak üzere insan immünoterapilerini incelemek için HIS fare modelini kullanıyorlar. Bu preklinik modeller, insan kanserlerinin heterojenliği konularının ele alınmasına yardımcı olur ve ayrıca tedavi başarısını tahmin edebilir ve bağışıklıkla ilişkili ilaç toksisitelerini izleyebilir 9,10.
İnsan hematopoetik kök hücrelerinin tanıtılması yoluyla insan bağışıklık sistemine sahip bir fare modelinin üretilmesi, ksenograftı reddetmeyecek bir alıcı immün yetmezlikli fare gerektirir. Mevcut HIS fare modelleri, 30 yıl önce bildirilen immün yetmezlikli fare suşlarından türetilmiştir. Tanımlanan ilk immün yetmezlikli fare suşu, T ve B hücreleri11’den yoksun SCID fareleriydi, bunu insan CD47 molekülü12,13’e NOD SIRPa alelinin bağlanmasının artması nedeniyle, insan hücrelerine fare makrofaj toleransından sorumlu bir SIRPa polimorfizmine sahip hibrit bir NOD-SCID izledi. 2000’li yılların başında, IL-2 reseptörünün (IL-2Rγc) ortak gama zincirinin hem BALB / c hem de NOD immün yetmezlikli suşlarda silinmesi, konakçı NK hücre gelişimini yasaklayan genetik delesyonlar nedeniyle gelişmiş insan engraftmanı için bir oyun değiştiriciydi14,15,16,17. BRG ve NRG fareleri gibi alternatif modeller, T ve B hücre reseptör geninin yeniden düzenlenmesi için gerekli olan Rag1 veya Rag2 geninin silinmesi ve böylece lenfositlerin olgunlaşması ve hayatta kalması yoluyla T ve B hücre eksikliğine ulaşır18,19. Burada kullanılan BRGS (BALB/c -Rag2 nullIl2R γCnullSirpαNOD) faresi, IL-2Rγ zincir eksikliğini ve Rag2-/- arka planındakiNOD SIRPα alelini birleştirerek, T, B veya NK hücreleri olmayan, ancak 30 haftadan fazla uzun süreli aşılamaya izin verecek kadar güçlü ve sağlıklı bir fareyle sonuçlanan yüksek immün yetmezlikli bir fare ile sonuçlanır13.
HIS fareleri çeşitli şekillerde üretilebilir, insan PBMC enjeksiyonu en doğrudan yöntem15,18,20’dir. Bununla birlikte, bu fareler, 12 haftalıkken greft versus host hastalığı (GVHD) ile sonuçlanan ve uzun süreli çalışmaları önleyen aktif insan T hücrelerinin belirgin bir genişlemesine sahiptir. Alternatif olarak, göbek kordon kanı (CB), kemik iliği ve fetal karaciğerden elde edilen insan hematopoetik kök hücreleri, insan bağışıklık sistemi de novo’nun engraftasyonu ve üretimi için de kullanılabilir. Bu sistemde, hematopoetik kök hücreler, çoğunlukla T hücreleri geliştiren PBMC farelerine kıyasla, fare konakçısına önemli ölçüde toleranslı olan T, B ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin üretilmesiyle çok soylu bir insan bağışıklık sistemi üretir. Bu nedenle, GVHD yoktur veya büyük ölçüde gecikmiştir ve çalışmalar 10 aya kadar olan farelere genişletilebilir. CB, genetik olarak aynı bağışıklık sistemlerine sahip birden fazla HIS faresinin aşılanmasını kolaylaştıran kolay, erişilebilir ve invaziv olmayan bir CD34 + insan hematopoetik kök hücre kaynağı sağlar 17,18,20,21. Son birkaç yılda, HIS fare modelleri immünoterapiyi ve TME 3,4,5,6’yı incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu farelerde insan kaynaklı bağışıklık sistemlerinin gelişmesine rağmen, insan ksenogreft tümörleri, kontrol immün yetmezlikli farelere kıyasla benzer oranlarda büyür ve aşılanmış PDX’in mikro ortamını korumak için önemli olan kanser hücreleri ile bağışıklık hücreleri arasındaki karmaşık etkileşime izin verir 3,7,8 . Bu protokol, PDX’ler ve CDX’ler ile HIS-BRGS farelerde tedavileri test eden 50’den fazla çalışma gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Önemli bir sonuç, HBYS farelerindeki insan tümörlerinin, tümörün ilk hasta örneğine göre moleküler değerlendirmesi ve immün infiltrasyon özellikleri 3,22,23 ile tanımlandığı gibi benzersiz TME’lerini koruduğudur. Grubumuz, çok parametreli akım sitometrisi kullanılarak hem immün organlarda hem de tümörde HBYS’nin derinlemesine değerlendirilmesine odaklanmaktadır. Burada, BRGS farelerinin insancıllaştırılması, kimerizmin değerlendirilmesi, insan tümörlerinin implantasyonu, tümör büyüme ölçümleri, kanser tedavisi uygulaması ve HIS hücrelerinin akış sitometrisi ile analizi için bir protokol açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son 6 yılda, hem immünoloji hem de insanlaştırılmış farelerdeki uzmanlığımızı kullanarak, araştırma ekibimiz çeşitli insan tümörleri üzerinde immünoterapileri test etmek için çok ihtiyaç duyulan bir klinik öncesi model geliştirdi 3,7,30,31. Bu protokol, immünoterapi merkezli insan T hücresi popülasyonlarına özel dikkat göstererek, modelin değişkenliğinin dikkat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hem Hayvan Araştırma Tesisi’ne (OLAR) farelerimize gösterdikleri özen için hem de enstitümüzdeki Kanser Merkezi Destek Hibesi (P30CA046934) tarafından desteklenen Akış Sitometrisi Ortak Kaynağı’na tüm çalışmalarımızda muazzam yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca, HIS-BRGS modelimizde insan PDX’lerine immünoterapileri inceleyen açılış işbirliklerimiz için hem Gail Eckhardt’a hem de Anna Capasso’ya teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri P30CA06934 Kanser Merkezi Destek Hibesi tarafından PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Paylaşılan Kaynak, RRID: SCR_021990 ve Akış Sitometrisi Paylaşılan Kaynağı, RRID: SCR_022035 kullanılarak desteklenmiştir. Bu araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri NIAID tarafından 75N93020C00058 Sözleşme Numarası altında desteklenmiştir.
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
Referências
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
- Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
- Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
- Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
- Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
- Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
- Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
- Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
- Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
- Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
- Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
- Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
- Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
- Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
- Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
- Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
- Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
- Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
- Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
- Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
- Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
- Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
- Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
- Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).
