Одноклеточный анализ экспрессии генов Pseudomonas syringae в растительной ткани
Summary
В настоящем протоколе описывается способ, который позволяет проводить анализ экспрессии одноклеточных генов в популяциях Pseudomonas syringae , выращенных в апопласте растения.
Abstract
Множество патогенных микроорганизмов постоянно атакуют растения. Видовой комплекс Pseudomonas syringae включает грамотрицательные растительно-патогенные бактерии, имеющие особое значение для широкого круга хозяев. P. syringae проникает в растение с поверхности листа и быстро размножается внутри апопласта, образуя микроколонии, занимающие межклеточное пространство. Конститутивная экспрессия флуоресцентных белков бактериями позволяет визуализировать микроколонии и отслеживать развитие инфекции на микроскопическом уровне. Последние достижения в области анализа отдельных клеток выявили большую сложность, достигаемую клональными изогенными бактериальными популяциями. Эта сложность, называемая фенотипической гетерогенностью, является следствием межклеточных различий в экспрессии генов (не связанных с генетическими различиями) среди бактериального сообщества. Для анализа экспрессии отдельных локусов на одноклеточном уровне широко использовались транскрипционные слияния с флуоресцентными белками. В стрессовых условиях, таких как те, которые возникают во время колонизации растительного апопласта, P. syringae дифференцируется в отдельные субпопуляции, основанные на гетерогенной экспрессии ключевых генов вирулентности (т.е. системы секреции Hrp типа III). Тем не менее, одноклеточный анализ любой данной популяции P. syringae , извлеченной из растительной ткани, затруднен из-за клеточного мусора, высвобождаемого во время механического разрушения, присущего процессам инокуляции и бактериальной экстракции. В настоящем докладе подробно описывается метод, разработанный для мониторинга экспрессии генов P. syringae , представляющих интерес, на одноклеточном уровне во время колонизации арабидопсиса и бобовых растений. Описана подготовка растений и бактериальных суспензий, используемых для инокуляции с помощью вакуумной камеры. Здесь также объясняется восстановление эндофитных бактерий из зараженных листьев путем экстракции апопластической жидкости. Методы бактериальной инокуляции и бактериальной экстракции эмпирически оптимизированы для минимизации повреждения растений и бактериальных клеток, в результате чего получаются бактериальные препараты, оптимальные для микроскопии и анализа проточной цитометрии.
Introduction
Патогенные бактерии проявляют различия в различных фенотипах, что приводит к образованию субпопуляций в генетически идентичных популяциях. Это явление известно как фенотипическая гетерогенность и было предложено в качестве стратегии адаптации во время взаимодействия бактерий с хозяином1. Последние достижения в области оптического разрешения конфокальных микроскопов, проточной цитометрии и микрофлюидики в сочетании с флуоресцентными белками способствовали одноклеточному анализу бактериальных популяций2.
Грамотрицательная синегнойная палочка Pseudomonas syringae является архетипической патогенной бактерией растений из-за ее академического и экономического значения3. Жизненный цикл P. syringae связан с водным циклом4. P. syringae проникает в межклеточные промежутки между клетками мезофилла, апопластом листа растения, через естественные отверстия, такие как устьица или раны5. Попав в апопласт, P. syringae полагается на систему секреции III типа (T3SS) и транслоцированные эффекторы III типа (T3E) для подавления иммунитета растений и манипулирования клеточными функциями растений в интересах патогена6. Экспрессия T3SS и T3E зависит от главного регулятора HrpL, альтернативного сигма-фактора, который связывается с мотивами hrp-бокса в промоторной области генов-мишеней7.
Генерируя расположенные в хромосомах слияния транскрипции с генами флуоресцентных белков ниже по течению от интересующего гена, можно контролировать экспрессию генов на основе уровней флуоресценции, испускаемых на уровне8 отдельных клеток. С помощью этого метода установлено, что экспрессия hrpL неоднородна как в бактериальных культурах, выращенных в лаборатории, так и в бактериальных популяциях, извлеченных из растительного апопласта 8,9. Хотя анализ экспрессии генов на уровне отдельных клеток обычно проводится в бактериальных культурах, выращенных в лабораторных средах, такие анализы также могут проводиться на бактериальных популяциях, растущих внутри растения, что дает ценную информацию о формировании субпопуляций в естественном контексте. Потенциальным ограничением для анализа бактериальных популяций, извлеченных из растения, является то, что классические методы инокуляции путем инфильтрации под давлением шприца в апопласт с последующей бактериальной экстракцией путем мацерации ткани листа обычно генерируют большое количество клеточных растительных остатков, которые мешают последующему анализу10. Большая часть клеточного мусора состоит из автофлуоресцентных фрагментов хлоропластов, которые перекрываются флуоресценцией GFP, что приводит к вводящим в заблуждение результатам.
Настоящий протокол описывает процесс анализа гетерогенности экспрессии одноклеточных генов в двух модельных патосистемах: той, которая сформирована P. syringae pv. штамм томатов DC3000 и Arabidopsis thaliana (Col-0), а другой – P. syringae pv. фазоликола штамма 1448А и бобовые растения (сорт Phaseolus vulgaris Canadian Wonder). Предложен метод инокуляции, основанный на вакуумной инфильтрации с использованием вакуумной камеры и насоса, что позволяет быстро и без повреждений проникать в целые листья. Кроме того, в качестве улучшения по сравнению с традиционными протоколами используется более щадящий метод извлечения бактериальной популяции из апопласта, который значительно уменьшает разрушение тканей, основанный на извлечении апопластической жидкости путем применения циклов положительного и отрицательного давления с использованием небольшого объема в шприце.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный здесь способ описывает неинвазивную процедуру, которая позволяет инфильтрации бактерий в ткани листвы растений, что позволяет быстро инокуляцию больших объемов, сводя к минимуму разрушение тканей. Одной из характеристик видового комплекса P. syringae является способн…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом проекта RTI2018-095069-B-I00, финансируемым MCIN/AEI/10.13039/501100011033/, и «ERDP: способ сделать Европу». J.S.R. финансировался Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. финансировался за счет гранта проекта P18-RT-2398 от Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
Referências
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. . Robust Statistics. , (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
