Encellsanalys av uttrycket av Pseudomonas syringae-gener i växtvävnaden
Summary
Detta protokoll beskriver en metod som möjliggör encellsanalys av genuttryck på Pseudomonas syringae-populationer odlade inom växtapoplasten.
Abstract
En uppsjö av patogena mikroorganismer attackerar ständigt växter. Artkomplexet Pseudomonas syringae omfattar gramnegativa växtpatogena bakterier av särskild relevans för ett stort antal värdar. P. syringae kommer in i växten från bladytan och multiplicerar snabbt inom apoplasten och bildar mikrokolonier som upptar det intercellulära utrymmet. Det konstitutiva uttrycket av fluorescerande proteiner av bakterierna möjliggör visualisering av mikrokolonierna och övervakning av infektionens utveckling på mikroskopisk nivå. Nya framsteg inom encellsanalys har avslöjat den stora komplexitet som uppnås av klonala isogena bakteriepopulationer. Denna komplexitet, kallad fenotypisk heterogenitet, är konsekvensen av cell-till-cell-skillnader i genuttryck (inte kopplat till genetiska skillnader) bland bakteriesamhället. För att analysera uttrycket av enskilda loci på encellsnivå har transkriptionella fusioner till fluorescerande proteiner använts i stor utsträckning. Under stressförhållanden, såsom de som inträffar under kolonisering av växtapoplasten, differentierar P. syringae i distinkta subpopulationer baserat på det heterogena uttrycket av viktiga virulensgener (dvs Hrp typ III-sekretionssystemet). Emellertid, encellsanalys av en given P. syringae-population som återhämtats från växtvävnad är utmanande på grund av det cellulära skräpet som frigörs under den mekaniska störningen som är inneboende i inokulerings- och bakterieextraktionsprocesserna. Denna rapport beskriver en metod som utvecklats för att övervaka uttrycket av P. syringae-gener av intresse på encellsnivå under koloniseringen av Arabidopsis och bönplantor. Beredningen av växterna och de bakteriesuspensioner som används för inokulering med användning av en vakuumkammare beskrivs. Återhämtningen av endofytiska bakterier från infekterade löv genom apoplastisk vätskeextraktion förklaras också här. Både bakterieinokulerings- och bakterieextraktionsmetoderna är empiriskt optimerade för att minimera växt- och bakteriecellskador, vilket resulterar i bakteriepreparat optimala för mikroskopi och flödescytometrianalys.
Introduction
Patogena bakterier uppvisar skillnader i olika fenotyper, vilket ger upphov till bildandet av subpopulationer inom genetiskt identiska populationer. Detta fenomen är känt som fenotypisk heterogenitet och har föreslagits som en anpassningsstrategi under bakterie-värdinteraktioner1. Nya framsteg inom optisk upplösning av konfokalmikroskop, flödescytometri och mikrofluidik, i kombination med fluorescerande proteiner, har främjat encellsanalyser av bakteriepopulationer2.
Den gramnegativa Pseudomonas syringae är en arketypisk växtpatogen bakterie på grund av både dess akademiska och ekonomiska betydelse3. Livscykeln för P. syringae är kopplad till vattnets kretslopp4. P. syringae kommer in i de intercellulära utrymmena mellan mesofyllcellerna, växtbladets apoplast, genom naturliga öppningar som stomata eller sår5. En gång inom apoplasten förlitar sig P. syringae på typ III-sekretionssystemet (T3SS) och typ III-translokerade effektorer (T3E) för att undertrycka växtimmunitet och manipulera växtcellulära funktioner till förmån för patogenen6. Uttrycket av T3SS och T3E beror på masterregulatorn HrpL, en alternativ sigmafaktor som binder till hrp-boxmotiven i promotorregionen för målgenerna7.
Genom att generera kromosomlokaliserade transkriptionsfusioner till fluorescerande proteingener nedströms genen av intresse kan man övervaka genuttryck baserat på fluorescensnivåerna som emitteras på encellsnivå8. Med hjälp av denna metod har det fastställts att uttrycket av hrpL är heterogent både inom bakteriekulturer odlade i laboratoriet och inom bakteriepopulationer som återvunnits från växtapoplasten 8,9. Även om genuttrycksanalys på encellsnivå vanligtvis utförs i bakteriekulturer som odlas i laboratoriemedia, kan sådana analyser också utföras på bakteriepopulationer som växer inom växten, vilket ger värdefull information om bildandet av subpopulationer i det naturliga sammanhanget. En potentiell begränsning för analys av bakteriepopulationer extraherade från växten är att klassiska inokuleringsmetoder genom spruttryckinfiltration i apoplasten, följt av bakteriell extraktion genom maceration av bladvävnaden, vanligtvis genererar en stor mängd cellulärt växtskräp som stör nedströmsanalys10. De flesta cellulära skräp består av autofluorescerande fragment av kloroplaster som överlappar GFP-fluorescens, vilket resulterar i vilseledande resultat.
Detta protokoll beskriver processen för att analysera encellsgenuttryckets heterogenitet i två modellpatosystem: det som bildas av P. syringae pv. tomatstam DC3000 och Arabidopsis thaliana (Col-0), och den andra av P. syringae pv. phaseolicola stam 1448A och bönplantor (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). En inokuleringsmetod föreslås baserad på vakuuminfiltration med hjälp av en vakuumkammare och en pump, vilket resulterar i en snabb och skadefri metod för att infiltrera hela blad. Dessutom, som en förbättring av konventionella protokoll, används en mildare metod för att extrahera bakteriepopulationen från apoplasten som signifikant minskar vävnadsstörningar, baserat på extraktion av apoplastvätska genom att applicera cykler av positivt och negativt tryck med en liten mängd volym i en spruta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som presenteras här beskriver ett icke-invasivt förfarande som möjliggör infiltration av bakterier i växtbladvävnaden, vilket möjliggör snabb inokulering av stora volymer samtidigt som vävnadsstörningar minimeras. En av egenskaperna hos P. syringae-artkomplexet är förmågan att överleva och sprida sig inuti växtapoplasten och på växtytan som epifyt14. Således kan möjligheten att bakterierna extraherade med hjälp av detta protokoll endast kommer från växtapopla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av projektbidrag RTI2018-095069-B-I00 finansierat av MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ och av “ERDP: Ett sätt att skapa Europa”. JSR finansierades av Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. finansierades av Project Grant P18-RT-2398 från Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
Referências
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. . Robust Statistics. , (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
