زرع تقويم العظام للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في الفئران يلخص سرطان القولون والمستقيم المتقدم
Summary
يصف هذا البروتوكول الزرع التقويمي للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة. يلخص النموذج المرض النقيلي المتقدم لسرطان القولون والمستقيم ويسمح بتقييم الأدوية العلاجية الجديدة في سيناريو ذي صلة سريريا لنقائل الرئة والكبد.
Abstract
على مدى العقد الماضي ، تم إنشاء نماذج أكثر تطورا لسرطان القولون والمستقيم قبل السريري (CRC) باستخدام الخلايا السرطانية المشتقة من المريض والأورام 3D. نظرا لأن عضويات الورم المشتقة من المريض يمكن أن تحتفظ بخصائص الورم الأصلي ، فإن هذه النماذج قبل السريرية الموثوقة تمكن من فحص أدوية السرطان ودراسة آليات مقاومة الأدوية. ومع ذلك ، يرتبط الموت المرتبط ب CRC في المرضى في الغالب بوجود مرض نقيلي. لذلك من الضروري تقييم فعالية العلاجات المضادة للسرطان في النماذج ذات الصلة في الجسم الحي التي تلخص حقا السمات الجزيئية الرئيسية لورم خبيث للسرطان البشري. لقد أنشأنا نموذجا تقويميا يعتمد على حقن الخلايا السرطانية المشتقة من مريض CRC مباشرة في جدار الأعور للفئران. تطور هذه الخلايا السرطانية أوراما أولية في الأعور تنتقل إلى الكبد والرئتين ، والتي يتم ملاحظتها بشكل متكرر في المرضى الذين يعانون من CRC المتقدم. يمكن استخدام نموذج الماوس CRC هذا لتقييم استجابات الأدوية التي تتم مراقبتها بواسطة التصوير المقطعي المحوسب (μCT) ، وهي طريقة تصوير صغيرة النطاق ذات صلة سريريا يمكنها بسهولة تحديد الأورام الأولية أو النقائل في المرضى. هنا ، نصف الإجراء الجراحي والمنهجية المطلوبة لزرع الخلايا السرطانية المشتقة من المريض في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي الثاني للوفاة بالسرطان في جميع أنحاء العالم1. إن القدرة على توليد نماذج الورم في المختبر أو في الجسم الحي المشتقة من الخلايا السرطانية الفردية للمريض لديها طب دقيق متقدم في علم الأورام. على مدى العقد الماضي ، تم استخدام المواد العضوية المشتقة من المرضى (PDOs) أو الطعوم الخارجية (PDXs) من قبل العديد من المجموعات البحثية حولالعالم 2. PDOs هي هياكل متعددة الخلايا في المختبر تشبه ميزات أنسجة الورم الأصلية ويمكنها التنظيم الذاتي والتجديد الذاتي3. يمكن استخدام هذه النماذج الواعدة في المختبر بنجاح لفحص الأدوية وتسهيل البحث الانتقالي. على الجانب الآخر ، تلخص نماذج PDX بأمانة اتفاقية حقوق الطفل الأصلية على جميع المستويات ذات الصلة ، من الأنسجة إلى السمات الجزيئية والاستجابة للأدوية 2,4.
في الجسم الحي تزرع نماذج PDX في الغالب كأورام تحت الجلد في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. باستخدام هذا النهج ، أصبحت PDXs المعيار الذهبي في أبحاث السرطان ، خاصة لدراسة حساسية الأدوية أو مقاومتها. ومع ذلك ، ترتبط الوفيات المرتبطة ب CRC في الغالب بوجود آفات نقيلية في الكبد أو الرئة أو التجويف البريتوني ، ولا يمكن لأي من النهجين (PDO أو PDX) تلخيص الإعداد السريري المتقدم. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن الموقع المحدد لنمو الورم يحدد الخصائص البيولوجية المهمة التي لها تأثير على فعالية الدواء وتشخيص المرض2. لذلك ، هناك حاجة ملحة لإنشاء نماذج ما قبل السريرية التي يمكن استخدامها لتقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان في بيئة النقيلي ذات الصلةسريريا 6.
يمكن أن تعمل ماسحات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT) كماسحات ضوئية مقطعية سريرية مصغرة ، مما يوفر تصويرا أوليا للورم وورم خبيث في الفئران بدقة صورة متدرجة تتناسب مع صور التصوير المقطعي المحوسب لمرضى السرطان7. لمواجهة تباين الأنسجة الرخوة الضعيف لتقنية μCT ، يمكن استخدام عوامل التباين المعالجة باليود الإشعاعي لتحسين التباين وتقييم عبء الورم. باستخدام نهج التباين المزدوج ، يتم إعطاء اليود الفموي وداخل الصفاق في أوقات مختلفة. يساعد التباين الذي يتم إعطاؤه عن طريق الفم على تحديد الحدود بين أنسجة الورم ومحتوى الأعور داخل الأمعاء. على الجانب الآخر ، يسمح التباين الذي يتم إعطاؤه داخل الصفاق بتحديد الحدود الخارجية لكتلة الورم ، والتي تنمو بشكل متكرر وتغزو الصفاق8.
تصف المخطوطة بروتوكولا لإجراء زرع تقويم العظام للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة ، ومنهجية مراقبة نمو الورم المعوي باستخدام التصوير المقطعي المحوسب. تظهر المخطوطة الحالية أن النموذج يلخص السيناريو السريري لأورام الأمعاء المتقدمة والأمراض النقيلي في مرضى CRC التي لا يمكن دراستها باستخدام نماذج PDO أو PDXO. نظرا لأن نماذج PDX التقويمية ل CRC تلخص السيناريو السريري لمرضى CRC ، فإننا نستنتج أنها الأفضل حتى الآن لاختبار فعالية الأدوية المضادة للأورام في أورام الأمعاء المتقدمة والأمراض النقيلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
على مدى العقود القليلة الماضية ، تم تطوير العديد من العلاجات الجديدة المضادة للسرطان واختبارها في المرضى الذين يعانون من أنواع مختلفة من الأورام ، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم (CRC). على الرغم من أن النتائج الواعدة في النماذج قبل السريرية قد لوحظت في كثير من الحالات ، إلا أن الفعالية ا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر مؤسسة Cellex وشبكة CIBERONC ومعهد الصحة كارلوس الثالث لدعمهم. علاوة على ذلك ، نشكر أيضا منصة التصوير قبل السريري في معهد فال ديبرون للأبحاث (VHIR) ، حيث تم إجراء التجارب.
Materials
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | – | – | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | – | – | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | – | – | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | – | – | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | – | – | |
| Heating pad | – | – | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | – | – | |
| Surfasafe | – | – | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
Referências
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. Small animal micro-CT colonography. Methods. 50 (1), 36-41 (2010).
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
