Reconstitutie cytoarchitectuur en functie van menselijke epitheelweefsels op een open-top orgaanchip

Summary

Het huidige protocol beschrijft de mogelijkheden en de essentiële kweekmodaliteiten van de Open-Top Organ-Chip voor de succesvolle vestiging en rijping van organ-on-chip culturen van volledige dikte van primaire weefsels (huid, alveolus, luchtwegen en darm), waardoor de mogelijkheid wordt geboden om verschillende functionele aspecten van de menselijke epitheliale / mesenchymale en vasculaire niche-interface in vitro te onderzoeken.

Abstract

Bijna alle menselijke organen zijn bekleed met epitheelweefsels, bestaande uit een of meerdere lagen van nauw verbonden cellen georganiseerd in driedimensionale (3D) structuren. Een van de belangrijkste functies van epithelia is de vorming van barrières die de onderliggende weefsels beschermen tegen fysieke en chemische beledigingen en infectieuze agentia. Bovendien bemiddelen epithelia het transport van voedingsstoffen, hormonen en andere signaalmoleculen, waardoor vaak biochemische gradiënten ontstaan die de celpositionering en compartimentering in het orgaan sturen. Vanwege hun centrale rol bij het bepalen van de structuur en functie van het orgaan, zijn epithelia belangrijke therapeutische doelen voor veel menselijke ziekten die niet altijd worden vastgelegd door diermodellen. Naast de voor de hand liggende verschillen tussen soorten, wordt het uitvoeren van onderzoek naar barrièrefunctie en transporteigenschappen van epithelia bij dieren verder verergerd door de moeilijkheid om toegang te krijgen tot deze weefsels in een levend systeem. Hoewel tweedimensionale (2D) menselijke celculturen nuttig zijn voor het beantwoorden van fundamentele wetenschappelijke vragen, leveren ze vaak slechte in vivo voorspellingen op. Om deze beperkingen te overwinnen, is in het afgelopen decennium een overvloed aan micro-engineered biomimetische platforms, bekend als organen-op-een-chip, naar voren gekomen als een veelbelovend alternatief voor traditionele in vitro en dierproeven. Hier beschrijven we een Open-Top Organ-Chip (of Open-Top Chip), een platform dat is ontworpen voor het modelleren van orgaanspecifieke epitheelweefsels, waaronder huid, longen en de darmen. Deze chip biedt nieuwe mogelijkheden voor het reconstitueren van de meercellige architectuur en functie van epitheelweefsels, inclusief de mogelijkheid om een 3D-stromale component te recreëren door weefselspecifieke fibroblasten en endotheelcellen op te nemen in een mechanisch actief systeem. Deze Open-Top Chip biedt een ongekend hulpmiddel voor het bestuderen van epitheliale / mesenchymale en vasculaire interacties op meerdere resolutieschalen, van enkele cellen tot meerlaagse weefselconstructen, waardoor moleculaire dissectie van de intercellulaire overspraak van geëpitheliseerde organen in gezondheid en ziekte mogelijk wordt.

Introduction

Historisch gezien hebben wetenschappers vertrouwd op preklinische dierproeven voor het ontdekken van geneesmiddelen, maar een groeiend aantal van deze methoden is in twijfel getrokken vanwege de slechte correlatie met menselijke uitkomst¹. De implementatie van de “3V’s”-principes om dierproeven te vervangen, te verminderen en te verfijnen, spoort wetenschappers aan om nieuwe in vitro alternatieve methoden te vinden ter ondersteuning van de risicobeoordeling van preklinische geneesmiddelen en chemische toxicologie². Veel in vitro modellen die tot nu toe zijn ontwikkeld, missen echter de biologische architectuur, cellulaire complexiteit en mechanische omgeving die nodig zijn om de dynamische aard van menselijke levende organen samen te vatten ^3,4.

Conventionele in vitro preklinische systemen maken meestal gebruik van 2D-monoculturen van menselijke cellen die op een stijf plastic oppervlak zijn gekweekt. Deze methoden bieden een hulpmiddel voor het uitvoeren van eenvoudige mechanistische studies en maken een snelle screening van kandidaat-geneesmiddelen mogelijk. Vanwege hun relatief lage kosten en hoge robuustheid worden 2D-modellen vaak gecombineerd met automatische high-throughput-systemen en gebruikt voor de snelle identificatie van potentiële kandidaat-geneesmiddelen in de vroege fase van het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen ^5,6. Dergelijke 2D-modellen bieden echter geen translationele benadering voor het modelleren van weefselniveau, orgaanniveau of systemische reacties op therapeutische kandidaten, wat nodig is voor nauwkeurige voorspellingen van de veiligheid en werkzaamheid van geneesmiddelen tijdens de preklinische fase van hun ontwikkeling. Platte celculturen recapituleren de inheemse weefselmicro-omgeving niet, inclusief het complexe meercellige samenspel, biomechanische eigenschappen en driedimensionale (3D) architectuur van menselijke weefsels⁷. Cellen die op een plat oppervlak groeien, krijgen vaak geen volwassen fenotype en kunnen daarom niet reageren op farmacologische stimuli zoals ze zouden doen in het inheemse weefsel. Primaire menselijke alveolaire epitheelcellen die in vitro zijn gekweekt, vertonen bijvoorbeeld een plaveiselfenotype en verliezen belangrijke fenotypische markers, waaronder oppervlakteactieve eiwitten C en B (SP-C en SP-B)⁸. Naast onvoldoende differentiatie worden primaire cellen vaak ongevoelig voor biologische stressoren in vitro, omdat bepaalde biochemische routes geassocieerd met weefselontsteking niet-functioneel worden⁹. Een dergelijk verlies van celfunctie lijkt voornamelijk geassocieerd te zijn met het gebruik van stijve substraten en het gebrek aan oplosbare factoren die van nature worden vrijgegeven door weefselspecifieke stromale cellen zoals longfibroblasten en gladde spiercellen^10,11.

Het inzicht dat het gebrek aan chemo-fysieke en biologische complexiteit het fysiologische gedrag van cellen in vitro beperkt, heeft de ontwikkeling van meer geavanceerde meercellige modellen bevorderd, waarvan is bewezen dat ze de complexiteit van menselijke weefsels buiten het lichaam beter vastleggen^12,13. Sinds de creatie van de eerste co-cultuurmodellen in de vroege jaren 1970¹⁴, heeft de introductie van synthetische en natuurlijke hydrogels het vermogen om inheemse weefselmicro-omgevingen na te bootsen aanzienlijk verbeterd en is het een waardevol hulpmiddel geworden voor het stimuleren van cellulaire differentiatie, het begeleiden van de zelforganisatie van cellen in weefselachtige structuren en het herstel van inheemse weefselfuncties^15,16. Wanneer menselijke cellen bijvoorbeeld in de juiste 3D-steiger worden gekweekt, kunnen ze zichzelf rangschikken in functionele structuren zoals sferoïden of organoïden, waardoor stamcelmarkers tot expressie komen en zijn ze in staat tot zelfvernieuwing¹⁷. Menselijke cellen (inclusief stamcellen) daarentegen, wanneer ze op traditionele 2D-substraten worden gekweekt, verouderen snel en ondergaan senescentie na een paar passages¹⁸. Bovendien kunnen hydrogels worden “aangepast” aan specifieke weefseleigenschappen zoals porositeit, poriegrootte, vezeldikte, visco-elasticiteit, topografie en stijfheid of verder worden ontwikkeld met weefselafgeleide cellulaire componenten en / of bioactieve moleculen die emulatie van de fysiologische of pathologische omstandigheden mogelijk maken^19,20. Ondanks hun enorme potentieel voor het testen van geneesmiddelen, geven 3D-hydrogel-gebaseerde modellen die worden gebruikt in farmaceutisch onderzoek de complexe cytoarchitectuur van de in vivo weefsels niet volledig samen en missen ze belangrijke hemodynamische en mechanische stimuli die normaal aanwezig zijn in het menselijk lichaam, waaronder hydrostatische druk, cyclische rek en vloeistofafschuiving²¹.

Microfysiologische systemen (MPS’en) zoals Organs-on-chips (OOC’s) zijn onlangs naar voren gekomen als hulpmiddelen die in staat zijn om complexe fysiologische reacties in vitro vast te leggen ^22,23. Deze modellen maken vaak gebruik van microfluïdische platforms, die het mogelijk maken om de dynamische micro-omgeving van levende organen te modelleren.

We hebben de principes van 3D-weefselbio-engineering en mechanobiologie gecombineerd om een Open-Top Chip-model van complex menselijk epitheelweefsel te creëren. Dit stelde ons in staat om de meercellige en dynamische micro-omgeving van epitheelweefsels nauwkeurig samen te vatten. Dit omvat weefselspecifieke biochemische en biomechanische signalen die van nature aanwezig zijn in levende organen, maar vaak worden verwaarloosd door traditionele in vitro modellen²⁴. De Open-Top Chip bevat twee compartimenten: een vasculair compartiment (figuur 1A) en een stromaal compartiment (figuur 1B) gescheiden door een poreus membraan, waardoor de diffusie van voedingsstoffen tussen de twee kamers mogelijk is (figuur 1C). Het vasculaire compartiment wordt blootgesteld aan een continue vloeistofstroom om fysiologische schuifspanning te recapituleren, terwijl het rekbare ontwerp van de stromale kamer het mogelijk maakt om de mechanische belasting te modelleren die gepaard gaat met ademhalingsbewegingen of intestinale peristaltiek. Het stromale compartiment herbergt de afstembare 3D-hydrogelsteiger die is ontworpen om de fysiologische groei van weefselspecifieke fibroblasten te ondersteunen. Het bezit een verwijderbaar deksel dat de oprichting van een lucht-vloeistofinterface vergemakkelijkt, een aandoening die een grotere emulatie van de menselijke fysiologie van slijmvliesweefsels mogelijk maakt, evenals directe toegang tot het weefsel voor het rechtstreeks toedienen van geneesmiddelen op de epitheellaag. Aanvullende figuur 1 toont enkele van de belangrijkste componenten van het open-top chipontwerp, waaronder afmetingen en biologische compartimenten (aanvullende figuur 1A-D), evenals de belangrijkste technische stappen die in dit protocol worden beschreven (aanvullende figuur 1E).

Perfusie van de Open-Top Chip wordt bereikt met een programmeerbare peristaltische pomp (Figuur 1D). De peristaltische pompopstelling maakt het mogelijk om 12 Open-Top Chips tegelijkertijd te perfuseren. De meeste incubators kunnen twee opstellingen huisvesten die de kweek van maximaal 24 chips per incubator mogelijk maken. Mechanisch rekken wordt bereikt met behulp van een op maat gemaakte programmeerbare vacuümdrukregelaar (figuur 1E). Het bestaat uit een elektro-pneumatische vacuümregelaar die elektronisch wordt bestuurd door een digitaal-naar-analoog converter. Met andere woorden, de elektro-pneumatische vacuümregelaar genereert een sinusoïdaal vacuümprofiel met een amplitude en frequentie die door de gebruiker wordt bepaald. Cyclische spanning variërend van 0% tot 15% wordt gegenereerd door negatieve druk toe te passen op het vacuümkanaal van de Open-Top Chip met een amplitude variërend van 0 tot -90 kPa en een frequentie van 0,2 Hz. Het is een op maat gemaakt systeem dat gelijkwaardig is aan de in de handel verkrijgbare Flexcell Strain Unit die eerder is aangenomen en beschreven in andere papers²⁵. Om de mechanische weefselvervorming na te bootsen die bijvoorbeeld gepaard gaat met de ademhalingsbeweging van de long of de peristaltiek van de darm, past de pneumatische actuator sinusoïdale vacuüm / rekgolven toe waarvan de grootte en amplitude kunnen worden aangepast aan het fysiologische niveau van spanning en frequentie dat menselijke cellen ervaren in hun oorspronkelijke weefsel.

Hier beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare methode voor het engineeren en kweken van organotypische epitheelequivalenten op een prototype Open-Top Chip-platform. Het maakt het genereren van complexe orgaanmodellen zoals huid, alveolus, luchtwegen en dikke darm mogelijk, terwijl een vasculaire vloeistofstroom en mechanische stretching worden geïntegreerd. We zullen de belangrijkste technische aspecten schetsen waarmee rekening moet worden gehouden bij het implementeren van principes van tissue engineering voor het genereren van complexe epitheliale modellen. We bespreken de voordelen en mogelijke beperkingen van het huidige ontwerp.

Een overzicht van de belangrijkste stappen die worden gebruikt om weefsel- en orgaanrijping te bereiken, inclusief stromings- en rekparameters, wordt weergegeven in: Figuur 2 voor de huid, Figuur 3 voor de alveolus, Figuur 4 voor de luchtwegen en Figuur 5 voor de darm. Aanvullende informatie over de samenstelling van de media en de reagentia die worden gebruikt voor het kweken van de verschillende orgaanmodellen is opgenomen in de aanvullende tabellen (aanvullende tabel 1 voor de huid; aanvullende tabel 2 voor de alveolus; Aanvullende tabel 3 voor de luchtwegen en aanvullende tabel 4 voor de darm).

Protocol

Menselijke colonoïden werden verkregen uit darmresecties in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Biosafety Committee van het Cincinnati Children’s hospital (IBC 2017-2011). 1. Surface-activering Voorbereiding van activeringsbufferPlaats de crosslinker- en oplosmiddelbufferreagentia onder de bioveiligheidskast (BSC) en laat ze gedurende 10 minuten voor gebruik bij kamertemperatuur (RT) balanceren. Reconstitueer 5 mg crosslinker …

Representative Results

Micropatterning van het oppervlakMicropatterning van de extracellulaire matrix (ECM) kan worden gebruikt om de ruimtelijke configuratie van de intestinale crypte-interface te repliceren. De Open-Top Chip-configuratie kan worden aangepast om microgepatterde stempels te integreren die speciaal zijn ontworpen om de natuurlijke topografie van de colonepitheel-stroma-interface (figuur 6A, B) en de darmcrypten op micrometerschaal na te bootsen (<strong class="…

Discussion

De Open-Top Chip vertegenwoordigt een faciliterend platform voor het onderzoeken van het complexe cellulaire samenspel tussen endotheel, stroma en epitheel in een gecontroleerde micro-omgeving, in realtime. Deze technologie biedt cruciale voordelen ten opzichte van conventionele organotypische en organoïde culturen, zoals de integratie van fysieke en biochemische signalen die relevant zijn voor het reconstitueren van de micro-omgeving van menselijk weefsel, inclusief fluidic shear (flow), cyclisch stretchen en reconstru…

Materials

10x EMEM	Lonza	12-684F	Medium; Stroma
18 Gauge needle	MicroGroup	316H18RW	Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard
19 Gauge needle	MicroGroup	316H19RW	Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT	Cole-Palmer	EW-95723-12	Tube, 0.25 mm, 12/pack
70% ethanol and wipes	-	-	For surface sterilization
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Medium supplement
A-83-01	Tocris	2939
Adenine	Sigma	A9795
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634010
Airway Epithelial Cells	Lifeline Cell Technology	FC-0016
Aluminum foil	-	-	-
Alveolar cells	Cell Biologics	H6621
Anti-ABCA3	ABCAM	ab24751	Mouse monoclonal antibody [3C9]
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647	ABCAM	ab215225	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-Aquaporin5	ABCAM	ab92320	Rabbit monoclonal antibody [EPR3747]
Anti-beta IV Tubulin	ABCAM	ab11315	Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6]
Anti-CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	Mouse monoclonal [JC/70A] antibody
Anti-CK5	ABCAM	ab75869	Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6]
Anti-Cytokeratin 10	ThermoFisher	MA5-13705	Mouse monoclonal antibody (DE-K10)
Anti-Cytokeratin 14	ABCAM	ab7800	Mouse monoclonal antibody
Anti-E-Cadherin	ABCAM	ab1416	Mouse monoclonal antibody
Anti-Filaggrin	ThermoFisher	PA5-79267	Rabbit polyclonal antibody
Anti-HTI-56	Terrace Biotech	TB-29AHT1-56	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-HTII-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	Mouse monoclonal antibody (IgM)
Anti-Involucrin	ThermoFisher	MA5-11803	Mouse monoclonal antibody (SY5)
Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ	Biolengend	618902	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Ki67	ABCAM	ab8191	Mouse monoclonal antibody [B126.1]
Anti-LAMP3	ABCAM	ab111090	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mature SP-B	Seven Hill	WRAB-48604	Rabbit polyclonal antibody
Anti-MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Mucin-2	SantaCruz Biotechnology	sc-7314	Mouse monoclonal antibody (IgG1)
Anti-p63	Dako	GA662	Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63
Anti-PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Podoplanin (AT-1α)	ABCAM	ab128994	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B	ABCAM	ab40876	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Surfactant C	Seven Hill	WRAB-9337	Rabbit polyclonal antibody
Anti-Uteroglobin/SCGB1A1	Hycult Biotech	HM2178	Mouse monoclonal antibody [AY1E6]
Anti-VE-cadherin	ABCAM	ab33168	Rabbit polyclonal antibody
Anti-ZO-1	ThermoFisher	33-9100	Mouse monoclonal antibody [1A12]
Ascorbic acid	Sigma	A4544
Aspirating pipettes	Corning / Falcon	357558	2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips	-	-	Sterile (autoclaved)
B27	Thermo	17504044
Blocker BSA (10X) in PBS solution	ThermoFisher	37525	Blocker agent
Calcium Chloride	Sigma	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Collagen I	Advanced Biomatrix	5133	10 mg/mL (Stroma)
Collagen I	Advanced BioMatrix	5005	3 mg/mL (Vascular ECM)
Collagen IV	Sigma	C5533
Collagen-IV	Sigma	C5533-5MG	Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL
Colonic Fibroblasts	Cell Biologics	H6231
Colonic microvascular endothelial cells	Cell Biologics	H6203
Conical tubes	-	-	15 mL and 50 mL polypropylene, sterile
Crosslinker (ER-1)	Emulate	10461	5 mg powder
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571	DNA probe
Dermal fibroblasts	ATCC	PCS-201-010
Dermal microvascular endothelial cells	ATCC	CRL-3243
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM/F-12	GIBCO	11320082
DMEM/F-12, GlutaMAX	GIBCO	10565-018	Basal medium for ALI medium
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150105	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175472	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150107	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150073	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	ab175470	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150075	Donkey Anti-Mouse secondary antibody
Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+)	Corning	21-031-CV	1x
Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-60170	Medium supplement
F-12 Ham’s	Invitrogen	21700-108	For vascular ECM
FibriCol	Advanced BioMatrix	5133-20ML	Collagen-I solution (10 mg/mL)
Fibronectin	Corning	356008
Fibronectin, Human, Natural,	Corning	47743-654	human plasma fibronectin
Fine-tip precision tweezers	Aven	18056USA	Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers
Glutamax	Invitrogen	21700-108
Glutamax	Invitrogen	35050061
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	ab150080	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150115	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)	ABCAM	ab6785	Goat Anti-Mouse secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-21124	Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody
Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21042	Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody
Handheld vacuum aspirator	Corning	4930	-
Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS)	GE Healthcare Life Sciences	SH30066.03
Hemocytometer	-	-	-
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
Human [Leu15] – Gastrin	Sigma	G9145
Human colonoids	Obtained from clinical resections		Obtained from clinical resections
Human EGF Recombinant Protein	Thermo	PHG0311L
human epithelial growth factor	Thermo	PHG0311
HyClone FetalClone II Serum (U.S.)	GE Healthcare	SH30066.02HI	Sterile FBS heat-inactivated
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma	H4881
Hydrocortisone	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Ice bucket	-	-	-
Ismatec IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK	PromoCell	C-63821
Keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
Laminin	Biolamina	CT521-0501
Laminin, 521 CTG (CT521)	Biolamina	CT521-0501	human recombinant laminin 521
Lung Fibroblast	Cell Biologics	H6013
Lung Fibroblast	Lifeline Cell Technology	FC-0049
Lung microvascular endothelial cells	Lonza	CC-2527
Lung smooth muscle cells	Lifeline Cell Technology	FC-0046
Manual counter	-	-	-
Masterflex (TPE) Transfer Tubing	Cole-Palmer	FV-96880-02	PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Medium 199, no phenol red	Thermo	11043023
Microcentrifuge tube	-	-	1.5 mL, sterile
Microscope (with camera)	-	-	For bright-field imaging
N2	Sigma	17502001
N-acetyl cysteine	Sigma	A5099
Noggin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	N17001
Normal Goat Serum	ThermoFisher	50062Z	Blocking solution
O-phosphosrylethanolamine	Sigma	P0503
Paraformaldehyde (4% wt/vol)	EMS	15710	Fixing agent
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140122
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333	10,000 U/mL; 10 mg/mL
Pipette tips	-	-	P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion
Pipette	Gilson	F167380	P20, P200, and P1000
PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement)	AMSBIO (or Thermo)	N/A (or C1910828010)
Poly-L-Lysine coated microscope glass slides	Sigma	P0425	Glass slides
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesterone	Sigma	P8783
ProLong Gold	ThermoFisher	P36931	Antifade Mountant with DAPI
Retinoic Acid	Sigma	R2625
ROCK inhibitor (Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T conditioned medium)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots supplements	Lonza	CC-4124
SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM	Lonza	CC-4124	Medium supplements
SB2001190	Tocris	1264/10
Serological pipettes	-	-	2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM)	Lonza	CC-4124
Solvent Buffer (ER-2)	Emulate	10462	25 mL bottle
Steriflip-HV	Millipore	SE1M003M00	Sterile filtering conical tube
Sterilin 100 mm Square Petri Dishes	Thermo	103	Sterile, 1 per 6 chips
T25 flasks	-	-	-
T75 flasks	-	-	-
Tri-iodothyronine	Sigma	T5516
Triton X-100 (0.3% (vol/vol)	Sigma	T8787	Permeabilization agent
Trypan blue	Sigma	93595	0.4% solution
TrypEE solution	Sigma	12604013	Cell detaching solution
TWEEN-20	Sigma	P2287	Permeabilization agent
UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2)	VWR	21474-598	UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vacuum set-up	-	-	Minimum pressure: -70 kPa
Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420	Medium supplement
Von Willebrand Factor conjugated FITC	ABCAM	ab8822	Sheep polyclonal antibody
Water bath (or beads)	-	-	Set to 37 °C
Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium)	ATCC	CRL-2647