For at inducere eksperimentel autoimmun encephalomyelitis, en dyremodel af multipel sklerose, immuniseres mus med en vand-i-olie-emulsion indeholdende et autoantigen og fuldender Freunds adjuvans. Mens der findes flere protokoller til fremstilling af disse emulsioner, præsenteres en hurtig, enkel og standardiseret homogeniseringsprotokol til emulsionsforberedelse her.
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) deler lignende immunologiske og kliniske træk med multipel sklerose (MS) og bruges derfor i vid udstrækning som en model til at identificere nye lægemiddelmål for bedre patientbehandling. MS er kendetegnet ved flere forskellige sygdomsforløb: recidiverende-remitterende MS (RRMS), primær progressiv MS (PPMS), sekundær progressiv MS (SPMS) og en sjælden progressiv-recidiverende form for MS (PRMS). Selvom dyremodeller ikke nøjagtigt efterligner alle disse kontrasterende humane sygdomsfænotyper, er der EAE-modeller, der afspejler nogle af de forskellige kliniske manifestationer af MS. For eksempel efterligner myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG) -induceret EAE i C57BL / 6J mus human PPMS, mens myelin proteolipidprotein (PLP) -induceret EAE i SJL / J mus ligner RRMS. Andre autoantigener, såsom myelin basisk protein (MBP), og en række forskellige musestammer bruges også til at studere EAE. For at fremkalde sygdom i disse autoantigenimmuniserings EAE-modeller fremstilles en vand-i-olie-emulsion og injiceres subkutant. De fleste EAE-modeller kræver også en injektion af kighostetoksin for at sygdommen kan udvikle sig. For konsekvent og reproducerbar EAE-induktion er en detaljeret protokol til fremstilling af reagenerne til fremstilling af antigen / adjuvansemulsioner nødvendig. Metoden beskrevet her udnytter en standardiseret metode til at generere vand-i-olie-emulsioner. Det er enkelt og hurtigt og bruger en rystehomogenisator i stedet for sprøjter til fremstilling af kvalitetskontrollerede emulsioner.
En nedbrydning af immunologisk tolerance kan resultere i generering af autoimmune lidelser, såsom multipel sklerose (MS). Det anslås, at 2,8 millioner mennesker lever med MS på verdensplan1. Selvom den nøjagtige årsag til MS stadig er stort set ukendt, spiller dysregulering af autoreaktive T- og B-celler samt defekter i Treg-funktionen vigtige roller i patogenesen af sygdommen 2,3.
Dyremodeller af autoimmune sygdomme er vigtige værktøjer til at undersøge potentielle terapeutiske modaliteter. Den eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) model er blevet brugt i næsten et århundrede af forskere interesseret i MS4. I tidlige forsøg var forekomsten af sygdommen relativt lav. Introduktionen af komplet Freunds adjuvans (CFA), der indeholder Mycobacterium og pertussistoksin, muliggjorde konsekvent induktion af EAE hos mus4. Vigtigst er det nødvendigt at blande CFA med et centralnervesystem (CNS) -specifikt antigen for at generere en homogen vand-i-olie-emulsion til inducering af EAE. De mest almindelige aktuelt tilgængelige EAE-modeller er baseret på aktiv immunisering af mus med encephalitogene peptider. Musenes genetiske baggrund spiller en vigtig rolle i sygdomsmodtagelighed, med myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG35-55) og myelin proteolipidprotein (PLP139-151) peptider, der anvendes til at inducere EAE i henholdsvisC57BL / 6J og SJL mus. Imidlertid kan andre musestammer og CNS-afledte peptider også bruges.
Kvaliteten af CFA/peptidemulsionen er en kritisk faktor, der bestemmer sygdomspenetransen i den aktive immunisering EAE model6. En homogen vand-i-olie-emulsion skal fremstilles ved at blande de encephalitogene peptider opløst i vandig buffer med CFA, ellers vil dyr ikke udvikle sygdommen. Der er offentliggjort talrige protokoller om fremstilling af CFA/peptidemulsioner. Eksempler omfatter brugen af en hvirvel7, sonikering8, sprøjter og et trevejs T-stik9 eller en sprøjte kun5. Imidlertid er alle disse metoder vanskelige at standardisere og er ofte forbundet med lange og komplicerede protokoller.
Sammenlignet med alle ovennævnte metoder giver den enkle metode, der er beskrevet her til emulsionspræparat, fordelene ved ikke at have nogen person-til-person-forskelle og være relativt hurtig. Emulsionen genereres af en homogenisator, der ryster reagenserne med en indstillet hastighed, tid og temperatur, hvilket sikrer hurtige og ensartede resultater. Ud over at fremkalde sygdom i EAE-modellen kan denne metode også bruges til at studere andre autoimmune sygdomsmodeller såsom kollageninduceret arthritis (CIA) og antigeninduceret arthritis (AIA)6. Derfor forventes det, at denne metode kan bruges til konsekvent at fremkalde sygdom i andre dyremodeller, der er afhængige af vand-i-olie-emulsioner med autoantigener, såsom eksperimentel autoimmun neuritis (EAN)10, eksperimentel autoimmun thyroiditis (EAT)11, autoimmun uveitis (EAU)12 og myasthenia gravis (MG)13. Denne metode inducerer også generelle immunresponser såsom forsinket overfølsomhed (DTH) konsekvent6 og kan derfor bruges til at levere kræft- og malariavacciner (se diskussion).
Således er der udviklet en hurtig (total forberedelsestid ~ 30 min), enkel (alle reagenser kan fremstilles på forhånd og opbevares) og standardiseret (emulsionen opnås ved hjælp af en rystehomogenisator) metode og præsenteres her. CFA/antigenemulsioner, der er fremstillet ved hjælp af denne protokol, inducerer konsekvent sygdom i autoimmune dyremodeller.
Vand-i-olie-emulsioner, såsom antigen / Freunds adjuvans, er blevet brugt i mere end et halvt århundrede til at inducere EAE17. Der er i øjeblikket ingen standardiseret metode til fremstilling af antigenemulsioner, der er uafhængige af menneskelig indflydelse. Manuel blanding ved hjælp af sprøjter er standard for de fleste laboratorier, men denne metode er tidskrævende, resulterer ofte i et for stort tab af materiale, og kvaliteten varierer afhængigt af forskeren, der forbereder den.
<…The authors have nothing to disclose.
Forfatteren vil gerne anerkende dyrestaldene ved Lunds Universitet, Camilla Björklöv og Agnieszka Czopek for deres støtte og Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK, for konstruktiv kritik og sproglig støtte til udarbejdelsen af dette manuskript.
1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |