Визуализация митофагии флуоресцентными красителями для митохондрий и лизосом
Summary
Митофагия является основным механизмом контроля качества митохондрий. Однако оценке митофагии in vivo препятствует отсутствие надежных количественных анализов. Здесь представлен протокол наблюдения митофагии в живых клетках с использованием клеточного проникающего зелено-флуоресцентного красителя митохондрий и красителя красных флуоресцентных лизосом.
Abstract
Митохондрии, будучи электростанциями клетки, играют важную роль в биоэнергетике, генерации свободных радикалов, гомеостазе кальция и апоптозе. Митофагия является основным механизмом контроля качества митохондрий и обычно изучается с использованием микроскопических наблюдений, однако анализы митофагии in vivo трудно выполнить. Оценка митофагии путем визуализации живых органелл является альтернативным и необходимым методом митохондриальных исследований. Этот протокол описывает процедуры использования клеточного проникающего зелено-флуоресцентного красителя митохондрий MitoTracker Green и красного флуоресцентного лизосомного красителя LysoTracker Red в живых клетках, включая загрузку красителей, визуализацию митохондрий и лизосом, а также ожидаемые результаты. Также приведены подробные шаги по оценке митофагии в живых клетках, а также технические примечания о настройках программного обеспечения микроскопа. Этот метод может помочь исследователям наблюдать митофагию с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Кроме того, он может быть использован для количественной оценки митохондрий и лизосом и оценки морфологии митохондрий.
Introduction
Митохондрии являются электростанциями почти всех эукариотических клеток 1,2. В дополнение к производству АТФ путем окислительного фосфорилирования, митохондрии играют жизненно важную роль в других процессах, таких как биоэнергетика, гомеостаз кальция, генерация свободных радикалов, апоптоз и клеточный гомеостаз 3,4,5. Поскольку митохондрии генерируют активные формы кислорода (АФК) из нескольких комплексов в цепи переноса электронов, они постоянно стимулируются потенциальным окислительным стрессом, который в конечном итоге может привести к структурным повреждениям и дисфункции, когда система антиоксидантной защиты разрушается 6,7. Было обнаружено, что митохондриальная дисфункция способствует развитию многих заболеваний, включая метаболические нарушения, нейродегенерацию и сердечно-сосудистые заболевания8. Поэтому крайне важно поддерживать здоровые митохондриальные популяции и их правильную функцию. Митохондрии являются высокопластичными и динамичными органеллами; их морфология и функция контролируются механизмами контроля качества митохондрий, включая посттрансляционные модификации (ПТМ) митохондриальных белков, митохондриальный биогенез, слияние, деление и митофагию 9,10. Митохондриальное деление, опосредованное связанным с динамином белком 1 (DRP1), ГТФазой надсемейства динаминов белков, приводит к малым и круглым митохондриям и изолирует дисфункциональные митохондрии, которые могут быть очищены и деградированы митофагией11,12.
Митофагия — это клеточный процесс, который избирательно разрушает митохондрии путем аутофагии, обычно происходящей в поврежденных митохондриях после травмы, старения или стресса. Впоследствии эти митохондрии доставляются в лизосомы для деградации10. Таким образом, митофагия является катаболическим процессом, который помогает поддерживать количество и качество митохондрий в здоровом состоянии в широком диапазоне типов клеток. Он играет решающую роль в восстановлении клеточного гомеостаза в нормальных физиологических и стрессовых условиях13,14. Клетки характеризуются сложным механизмом митофагии, который индуцируется различными сигналами клеточного стресса и изменений в развитии. Регуляторные пути митофагии классифицируются как убиквитин-зависимые илирецептор-зависимые 15,16; убиквитин-зависимая аутофагия опосредована киназой PINK1 и рекрутированием убиквитин-лигазы Parkin E3 в митохондрии17,18, в то время как рецептор-зависимая аутофагия включает связывание рецепторов аутофагии с микротрубочкой-ассоциированной белковой легкой цепью LC3, которая опосредует митофагию в ответ на повреждение митохондрий19.
Просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) является наиболее часто используемым методом и до сих пор одним из лучших методов для наблюдения и обнаружения митофагии20. Морфологическими особенностями митофагии являются аутофагосомы или аутолизосомы, образованные слиянием аутофагосом с лизосомами, что можно наблюдать по изображениям электронной микроскопии21. Слабость электронной микроскопии (ЭМ), однако, заключается в неспособности контролировать динамические процессы митофагии, такие как деполяризация митохондрий, деление митохондрий и слияние аутофагосом и лизосом, в живой клетке20. Таким образом, оценка митофагии с помощью визуализации живых органелл является привлекательным альтернативным методом митохондриальных исследований. Метод визуализации живых клеток, описанный здесь, использует два флуоресцентных красителя для окрашивания митохондрий и лизосом. Когда происходит митофагия, поврежденные или лишние митохондрии, поглощенные аутофагосомами, окрашиваются в зеленый цвет митохондриальным красителем, в то время как красный краситель окрашивает лизосомы. Слияние этих аутофагосом и лизосом, называемых аутолизосомами, приводит к тому, что зеленая и красная флуоресценция перекрываются и проявляются в виде желтых точек, что указывает на возникновение митофагии22. Клеточно-проницаемый краситель митохондрий (MitoTracker Green) содержит умеренно тиол-реактивный хлорметиловый фрагмент для маркировки митохондрий23. Чтобы метить митохондрии, клетки просто инкубируются с красителем, который пассивно диффундирует через плазматическую мембрану и накапливается в активных митохондриях. Этот краситель митохондрий может легко окрашивать живые клетки и менее эффективен при окрашивании альдегидно-фиксированных или мертвых клеток. Лизосомный краситель (LysoTracker Red) представляет собой флуоресцентный ацидотропный зонд, используемый для маркировки и отслеживания кислых органелл в живых клетках. Этот краситель проявляет высокую селективность для кислых органелл и может эффективно маркировать живые клетки при наномолярных концентрациях24.
Здесь представлены процедуры использования этих флуоресцентных красителей в живых клетках, включая загрузку красителей и визуализацию митохондрий и лизосом. Этот метод может помочь исследователям наблюдать митофагию с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Он также может быть использован для количественной оценки митохондрий и лизосом и оценки морфологии митохондрий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, предоставляет метод оценки и мониторинга динамического процесса митофагии в живых клетках, включая аутофагосомы, лизосомы и деление митохондрий, путем совместного окрашивания с клеточными проницаемыми митохондриями и лизосомными красителями. Метод также м…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично профинансирована Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), Национальным фондом естественных наук Китая (81970333,31901044, и Программой для профессора специального назначения в Шанхайских высших учебных заведениях (GZ2020008).
Materials
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
Referências
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
