Ein innovativer 3D-gedruckter Einsatz, der für einfache 2D- und 3D-Zellkulturen entwickelt wurde
Summary
In dieser Arbeit wird ein neu entworfener 3D-gedruckter Einsatz als Modell der Co-Kultur vorgestellt und durch die Untersuchung der parakrinen interzellulären Kommunikation zwischen Endothelzellen und Keratinozyten validiert.
Abstract
Die klassischen Analysen der indirekten Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen erfordern den Einsatz konditionierter Medien. Darüber hinaus ist die Herstellung von konditionierten Medien nach wie vor zeitaufwändig und weit entfernt von physiologischen und pathologischen Zuständen. Obwohl einige Modelle der Co-Kultur kommerziell erhältlich sind, bleiben sie auf spezifische Assays beschränkt und eignen sich hauptsächlich für zwei Arten von Zellen.
Hier kommen 3D-gedruckte Inserts zum Einsatz, die mit zahlreichen funktionellen Assays kompatibel sind. Der Einsatz ermöglicht die Aufteilung einer Vertiefung einer 6-Well-Platte in vier Kammern. Eine Vielzahl von Kombinationen kann eingestellt werden. Darüber hinaus sind in jeder Wand der Kompartimente Fenster so gestaltet, dass eine potentielle interzelluläre Kommunikation zwischen jedem Kompartiment im Nährmedium volumenabhängig möglich ist. Zum Beispiel kann die parakrine interzelluläre Kommunikation zwischen vier Zelltypen in Monolayern, in 3D (Sphäroide) oder durch Kombination beider untersucht werden. Darüber hinaus kann ein Mix aus verschiedenen Zelltypen im selben Kompartiment im 2D- oder 3D-Format (Organoide) ausgesät werden. Das Fehlen eines Bodens in den 3D-gedruckten Einsätzen ermöglicht die üblichen Kulturbedingungen auf der Platte, eine mögliche Beschichtung auf der Platte, die den Einsatz enthält, und eine direkte Visualisierung durch optische Mikroskopie. Die Mehrfachkompartimente bieten die Möglichkeit, verschiedene Zelltypen unabhängig voneinander zu sammeln oder in jedem Kompartiment unterschiedliche Reagenzien für die RNA- oder Proteinextraktion zu verwenden. In dieser Studie wird eine detaillierte Methodik vorgestellt, um den neuen 3D-gedruckten Einsatz als Co-Kultursystem zu verwenden. Um die verschiedenen Fähigkeiten dieses flexiblen und einfachen Modells zu demonstrieren, wurden zuvor veröffentlichte funktionelle Assays der Zellkommunikation in den neuen 3D-gedruckten Inserts durchgeführt und als reproduzierbar nachgewiesen. Die 3D-gedruckten Einsätze und die konventionelle Zellkultur mit konditionierten Medien führten zu ähnlichen Ergebnissen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es sich bei dem 3D-gedruckten Einsatz um ein einfaches Gerät handelt, das an zahlreiche Modelle von Co-Kulturen mit adhärenten Zelltypen angepasst werden kann.
Introduction
In vivo kommunizieren Zellen entweder direkt (Zellkontakt) oder indirekt (durch Sekretion von Molekülen) miteinander. Um die Zellkommunikation zu untersuchen, können verschiedene Kokulturmodelle entwickelt werden, wie z. B. die direkte Co-Kultur (die verschiedenen Zelltypen befinden sich in direkter Interaktion im selben Well) und die kompartimentierte Co-Kultur (die verschiedenen Zelltypen befinden sich in indirekter Wechselwirkung in verschiedenen Kompartimenten eines Kultursystems)1. Darüber hinaus können konditionierte Medien für Co-Kultursysteme verwendet werden, bei denen die indirekte Wechselwirkung dadurch ermöglicht wird, dass sezernierte Moleküle, die in den konditionierten Medien eines Effektorzelltyps enthalten sind, auf eine Responderzelle Typ1 übertragen werden.
Im Falle von parakrinen Zellkommunikationsstudien liefern indirekte Co-Kultursysteme Modelle, die Zellinteraktionen in vivo stark widerspiegeln. Indirekte Kokultursysteme wurden entwickelt und kommerzialisiert, was die Etablierung indirekter Cokulturmodelle ermöglicht 2,3. Leider bieten die meisten indirekten Co-Kultursysteme nur zwei Kompartimente. Andere indirekte Co-Kultur-Systeme bieten mehrere Kompartimente, aber sie sind weniger skalierbar im Vergleich zu dem System, über das im vorliegenden Manuskript berichtet wird. Einige von ihnen erlauben keine klassische Visualisierung unter dem Mikroskop und stellen oft spezifische Anwendungsmethoden vor. In mehreren Studien wird die parakrine Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen mit dem konditionierten Medienmodell 4,5,6,7 untersucht. Dies ist eine einfachere Art der Untersuchung im Vergleich zu indirekten Co-Kultursystemen, da keine spezifischen Methoden oder Materialien festgelegt werden müssen1. Auf der anderen Seite ist die Herstellung von konditionierten Medien zeitaufwändig und liefert nur Informationen über die einseitige Zellsignalisierung (Effektor zu Responder)1.
In dieser Arbeit wird ein neuer, einfacher Weg zur Untersuchung der Zellkommunikation vorgeschlagen. Durch die Kombination mehrerer Zelltypen in direkter oder indirekter Interaktion und in 2D- oder 3D-Formaten bieten die gedruckten Inserts zahlreiche Vorteile für den einfachen Aufbau von Co-Kulturmodellen. Der 3D-gedruckte Einsatz ist für die Platzierung in den Vertiefungen von 6-Well-Platten geeignet und ist kreisförmig und ermöglicht die Trennung des Wells in vier Kammern (zwei große Fächer und zwei kleine Fächer; Abbildung 1A). Die 3D-gedruckten Einsätze zeichnen sich durch das Fehlen eines Bodens aus. Somit stehen die Zellen in direktem Kontakt mit der Platte, auf der der Einsatz platziert wird. Darüber hinaus kann jedes Fach unabhängig von den anderen beschichtet werden. Darüber hinaus kann das Zellverhalten leicht unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden. Das Vorhandensein von Kommunikationsfenstern in jeder Wand des Einsatzes ermöglicht es, zum optimalen Zeitpunkt ein gemeinsames Medium hinzuzufügen, um verschiedene Experimente der Co-Kultur durchzuführen. Zahlreiche Kombinationen von Kokulturen können durchgeführt werden, um die direkte und/oder indirekte Kommunikation zwischen mehreren Zelltypen zu untersuchen. So kann beispielsweise ein Modell der indirekten Co-Kultur zwischen vier verschiedenen Zelltypen in Monolayer und/oder in 3D (Sphäroide) entworfen werden. Eine Kombination aus direkten und indirekten Kokulturmodellen kann auch durch das Mischen verschiedener Zelltypen im selben Kompartiment durchgeführt werden. Die Wirkung komplexer Strukturen (Organoide, Gewebeexplantation usw.) auf verschiedene Zelltypen könnte ein weiteres Beispiel für Modelle sein, die erstellt werden können. Darüber hinaus sind die 3D-gedruckten Inserts kompatibel mit zellbiologischen Funktionsassays (Proliferation, Migration, Pseudoröhrenbildung, Differenzierung usw.) und mit biochemischen Tests (Extraktion von DNA, RNA, Protein, Lipiden usw.). Schließlich bieten die 3D-gedruckten Inserts eine breite Palette von experimentellen Schemata von Co-Kulturmodellen mit der Möglichkeit, gleichzeitig verschiedene Assays im selben Experiment in den verschiedenen Kompartimenten zu kombinieren.
Einige Kapazitäten der 3D-gedruckten Einsätze werden vorgestellt, um sie als schnelles und einfach zu bedienendes Co-Kulturmodell zu validieren. Im Vergleich zu einer bereits veröffentlichten Studie zur parakrinen Zellkommunikation wird die Fähigkeit der 3D-gedruckten Inserts als wertvolles Co-Kultur-Modell demonstriert. Um diesen Punkt zu beurteilen, wurde die Regulation der Endothelzellproliferation und -migration durch Keratinozyten zwischen dem 3D-gedruckten Insert-System und dem klassischen System unter Verwendung konditionierter Medien verglichen. Die 3D-gedruckten Einsätze ermöglichen es, im Vergleich zum herkömmlichen System mit konditionierten Medien schnell ähnliche Ergebnisse zu erzielen. In der Tat bieten die 3D-gedruckten Inserts ein robustes Modell, um Zellinteraktionen in beide Richtungen zu untersuchen, ohne dass konditionierte Medien hergestellt werden müssen, und mit der Möglichkeit, die Proliferations- und Migrationsassays im selben Experiment parallel durchzuführen.
Abschließend wird in dieser Arbeit ein neues und gebrauchsfertiges Modell zur Untersuchung der Zellkommunikation vorgeschlagen. Die 3D-gedruckten Einsätze sind mit allen adhärenten Zelltypen kompatibel und ermöglichen die Durchführung zahlreicher Kombinationen von Co-Kulturen, die darauf abzielen, näher an In-vivo-Bedingungen zu sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die indirekte Zellkommunikation wird üblicherweise mit konditionierten Medien oder Co-Kultursystemen untersucht. Die konditionierte Medienaufbereitung ist im Vorfeld der Experimente zeitaufwändig und beschränkt sich auf einseitige Effektanalysen. Die vorherige Studie von Colin-Pierre et al.8 unter Verwendung konditionierter Medien wurde die indirekte Zellkommunikation zwischen zwei Zelltypen (HDMECs und KORS) durchgeführt. Die Daten dieser früheren Studie zeigten die Wirkung von KORS…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde in Zusammenarbeit mit BASF Beauty Care Solutions durchgeführt. Frau Charlie Colin-Pierre ist eine von BASF / CNRS finanzierte Doktorandin.
Wir danken Herrn Mehdi Sellami für die Konzeption der 3D-gedruckten Einsätze.
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
Referências
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