सरल 2 डी और 3 डी सेल संस्कृतियों को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक अभिनव 3 डी-मुद्रित सम्मिलित
Summary
इस पेपर में, एक नए डिज़ाइन किए गए 3 डी-मुद्रित सम्मिलित को सह-संस्कृति के मॉडल के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और एंडोथेलियल कोशिकाओं और केराटिनोसाइट्स के बीच पैराक्रिन इंटरसेलुलर संचार के अध्ययन के माध्यम से मान्य किया जाता है।
Abstract
विभिन्न सेल प्रकारों के बीच अप्रत्यक्ष संचार के शास्त्रीय विश्लेषण के लिए वातानुकूलित मीडिया के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, वातानुकूलित मीडिया का उत्पादन समय लेने वाला और शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों से दूर रहता है। यद्यपि सह-संस्कृति के कुछ मॉडल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, वे विशिष्ट परखों तक ही सीमित रहते हैं और ज्यादातर दो प्रकार की कोशिकाओं के लिए होते हैं।
यहां, 3 डी-मुद्रित आवेषण का उपयोग किया जाता है जो कई कार्यात्मक परखों के साथ संगत हैं। सम्मिलित करने से 6-वेल प्लेट के एक कुएं को चार डिब्बों में अलग करने की अनुमति मिलती है। संयोजनों की एक विस्तृत श्रृंखला सेट की जा सकती है। इसके अलावा, डिब्बों की प्रत्येक दीवार में खिड़कियां डिज़ाइन की जाती हैं ताकि प्रत्येक डिब्बे के बीच संभावित अंतरकोशिकीय संचार संस्कृति माध्यम में मात्रा-निर्भर तरीके से संभव हो। उदाहरण के लिए, पैराक्रिन इंटरसेलुलर संचार का अध्ययन मोनोलेयर में चार सेल प्रकारों के बीच, 3 डी (स्फेरॉइड) में, या दोनों के संयोजन से किया जा सकता है। इसके अलावा, विभिन्न सेल प्रकारों के मिश्रण को 2 डी या 3 डी (ऑर्गेनोइड्स) प्रारूप में एक ही डिब्बे में बीज दिया जा सकता है। 3 डी-मुद्रित आवेषण में एक तल की अनुपस्थिति प्लेट पर सामान्य संस्कृति की स्थिति, सम्मिलित प्लेट पर संभावित कोटिंग और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है। कई डिब्बे स्वतंत्र रूप से विभिन्न सेल प्रकारों को इकट्ठा करने या प्रत्येक डिब्बे में, आरएनए या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए अलग-अलग अभिकर्मकों का उपयोग करने की संभावना प्रदान करते हैं। इस अध्ययन में, सह-संस्कृति प्रणाली के रूप में नए 3 डी-मुद्रित सम्मिलित का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान की जाती है। इस लचीले और सरल मॉडल की कई क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए, सेल संचार के पहले प्रकाशित कार्यात्मक परख नए 3 डी-मुद्रित आवेषण में किए गए थे और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होने का प्रदर्शन किया गया था। 3 डी-मुद्रित आवेषण और वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करके पारंपरिक सेल संस्कृति ने समान परिणाम दिए। अंत में, 3 डी-मुद्रित सम्मिलित एक सरल उपकरण है जिसे अनुयायी सेल प्रकारों के साथ सह-संस्कृतियों के कई मॉडलों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
विवो में, कोशिकाएं एक दूसरे के साथ या तो प्रत्यक्ष (सेल संपर्क) या अप्रत्यक्ष रूप से (अणुओं के स्राव द्वारा) संवाद करती हैं। सेल संचार का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न सह-संस्कृति मॉडल विकसित किए जा सकते हैं, जैसे कि प्रत्यक्ष सह-संस्कृति (विभिन्न सेल प्रकार एक ही कुएं में प्रत्यक्ष बातचीत में हैं) और कंपार्टमेंटल सह-संस्कृति (विभिन्न सेल प्रकार एक संस्कृति प्रणाली के विभिन्न डिब्बों में अप्रत्यक्ष बातचीत में हैं)1। इसके अलावा, वातानुकूलित मीडिया का उपयोग सह-संस्कृति प्रणालियों के लिए किया जा सकता है, जहां अप्रत्यक्ष बातचीत एक प्रभावक सेल प्रकार के वातानुकूलित मीडिया में निहित स्रावित अणुओं द्वारा सक्षम होती है जिसे उत्तरदाता सेल टाइप1 में स्थानांतरित किया जाता है।
पैराक्रिन सेल संचार अध्ययन के मामले में, अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति प्रणाली मॉडल प्रदान करती है जो विवो में सेल इंटरैक्शन को दृढ़ता से दर्शाती है। अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति प्रणालियों को विकसित और व्यावसायीकरण किया गया है, जिससे अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति मॉडल 2,3 की स्थापना की अनुमति मिलती है। दुर्भाग्य से, अधिकांश अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति प्रणालियां केवल दो डिब्बे प्रदान करती हैं। अन्य अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति प्रणालियां कई डिब्बे प्रदान करती हैं, लेकिन वे वर्तमान पांडुलिपि में रिपोर्ट की गई प्रणाली की तुलना में कम स्केलेबल हैं। उनमें से कुछ एक माइक्रोस्कोप के तहत शास्त्रीय विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति नहीं देते हैं, और वे अक्सर विशिष्ट अनुप्रयोग विधियों को प्रस्तुत करते हैं। कई अध्ययनों में, विभिन्न सेल प्रकारों के बीच पैराक्रिन संचार की जांच वातानुकूलित मीडिया मॉडल 4,5,6,7 द्वारा की जाती है। यह अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति प्रणालियों की तुलना में जांच का एक आसान तरीका है क्योंकिइसे स्थापित करने के लिए विशिष्ट तरीकों या सामग्रियों की आवश्यकता नहीं है। दूसरी ओर, वातानुकूलित मीडिया की तैयारी समय लेने वाली है और केवल एक-तरफ़ा सेल सिग्नलिंग (उत्तरदाता को प्रभावक) 1 पर जानकारी प्रदान करती है।
इस पेपर में, सेल संचार की जांच का एक नया, सरल तरीका प्रस्तावित है। प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष बातचीत में और 2 डी या 3 डी प्रारूपों में कई सेल प्रकारों के संयोजन की अनुमति देते हुए, मुद्रित प्रविष्टियां सह-संस्कृति मॉडल को आसानी से स्थापित करने के लिए कई फायदे पेश करती हैं। 6-वेल प्लेटों के कुओं में रखने के लिए अनुकूलित, 3 डी-मुद्रित सम्मिलित गोलाकार है और कुएं को चार डिब्बों (दो बड़े डिब्बे और दो छोटे डिब्बे) में अलग करने की अनुमति देता है; चित्रा 1 ए)। 3 डी-मुद्रित आवेषण को नीचे की अनुपस्थिति की विशेषता है। इस प्रकार, कोशिकाएं उस प्लेट के सीधे संपर्क में होती हैं जिस पर सम्मिलित किया जाता है। इसके अलावा, प्रत्येक डिब्बे को दूसरों से स्वतंत्र रूप से लेपित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत सेल व्यवहार का आसानी से पालन किया जा सकता है। सम्मिलित की प्रत्येक दीवार में संचार खिड़कियों की उपस्थिति सह-संस्कृति के विभिन्न प्रयोगों को करने के लिए एक सामान्य माध्यम के इष्टतम समय पर अतिरिक्त की अनुमति देती है। कई सेल प्रकारों के बीच प्रत्यक्ष और / या अप्रत्यक्ष संचार का अध्ययन करने के लिए सह-संस्कृति के कई संयोजन किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, मोनोलेयर और / या 3 डी (स्फेरॉइड) में चार अलग-अलग सेल प्रकारों के बीच अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति का एक मॉडल डिजाइन किया जा सकता है। एक ही डिब्बे में विभिन्न सेल प्रकारों को मिलाकर प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष सह-संस्कृति मॉडल का एक संयोजन भी किया जा सकता है। विभिन्न सेल प्रकारों पर जटिल संरचनाओं (ऑर्गेनोइड्स, ऊतक खोज, आदि) का प्रभाव उन मॉडलों का एक और उदाहरण हो सकता है जिन्हें बनाया जा सकता है। इसके अलावा, 3 डी-मुद्रित आवेषण सेल जीव विज्ञान कार्यात्मक परख (प्रसार, प्रवासन, स्यूडोट्यूब गठन, भेदभाव, आदि) और जैव रसायन परीक्षणों (डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, लिपिड, आदि के निष्कर्षण) के साथ संगत हैं। अंत में, 3 डी-मुद्रित आवेषण सह-संस्कृति मॉडल की प्रयोगात्मक योजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करते हैं, जिसमें विभिन्न डिब्बों में एक ही प्रयोग में एक साथ अलग-अलग परखों को संयोजित करने की संभावना होती है।
3 डी-मुद्रित आवेषण की कुछ क्षमताओं को एक तेज़ और उपयोग में आसान सह-संस्कृति मॉडल के रूप में मान्य करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। पैराक्रिन सेल संचार पर किए गए पहले प्रकाशित अध्ययन की तुलना में, 3 डी-मुद्रित प्रविष्टियों की एक मूल्यवान सह-संस्कृति मॉडल होने की क्षमता का प्रदर्शन किया जाता है। इस बिंदु का आकलन करने के लिए, केराटिनोसाइट्स द्वारा एंडोथेलियल सेल प्रसार और प्रवासन के विनियमन की तुलना 3 डी-मुद्रित सम्मिलित प्रणाली और वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करके शास्त्रीय प्रणाली के बीच की गई थी। 3 डी-मुद्रित आवेषण वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करके पारंपरिक प्रणाली की तुलना में तेजी से समान परिणाम प्राप्त करने की अनुमति देते हैं। दरअसल, 3 डी-मुद्रित आवेषण वातानुकूलित मीडिया का उत्पादन करने की आवश्यकता के बिना और एक ही प्रयोग में प्रसार और प्रवासन परख के समानांतर प्रदर्शन करने की संभावना के बिना दोनों दिशाओं में सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत मॉडल प्रदान करते हैं।
निष्कर्ष निकालने के लिए, इस पेपर में, सेल संचार का अध्ययन करने के लिए एक नया और उपयोग के लिए तैयार मॉडल प्रस्तावित है। सभी अनुयायी सेल प्रकारों के साथ संगत, 3 डी-मुद्रित आवेषण सह-संस्कृति के कई संयोजनों को करने की अनुमति देते हैं जिनका उद्देश्य विवो स्थितियों में करीब होना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अप्रत्यक्ष सेल संचार की जांच आमतौर पर वातानुकूलित मीडिया या सह-संस्कृति प्रणाली उपकरणों का उपयोग करके की जाती है। वातानुकूलित मीडिया तैयारी प्रयोगों में अपस्ट्रीम समय लेने वाली है, और यह विधि एक तरफ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन बीएएसएफ ब्यूटी केयर सॉल्यूशंस के सहयोग से किया गया था। सुश्री चार्ली कॉलिन-पियरे एक बीएएसएफ / सीएनआरएस-वित्त पोषित पीएचडी फेलो हैं।
हम 3 डी-मुद्रित आवेषण की अवधारणा के लिए श्री मेहदी सेलामी को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
Referências
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