En innovativ 3D-printad insats som är utformad för att möjliggöra enkla 2D- och 3D-cellkulturer

Summary

I denna artikel presenteras en nydesignad 3D-printad insats som en modell för samodling och valideras genom studier av den parakrina intercellulära kommunikationen mellan endotelceller och keratinocyter.

Abstract

De klassiska analyserna av indirekt kommunikation mellan olika celltyper kräver användning av betingade medier. Dessutom är produktionen av konditionerade medier fortfarande tidskrävande och långt ifrån fysiologiska och patologiska tillstånd. Även om ett fåtal modeller av samodling är kommersiellt tillgängliga, är de fortfarande begränsade till specifika analyser och är främst för två typer av celler.

Här används 3D-printade insatser som är kompatibla med många funktionella analyser. Insatsen gör det möjligt att separera en brunn i en 6-hålsplatta i fyra fack. Ett brett utbud av kombinationer kan ställas in. Dessutom är fönster utformade i varje vägg i facken så att potentiell intercellulär kommunikation mellan varje fack är möjlig i odlingsmediet på ett volymberoende sätt. Till exempel kan parakrin intercellulär kommunikation studeras mellan fyra celltyper i monolager, i 3D (sfäroider) eller genom att kombinera båda. Dessutom kan en blandning av olika celltyper sås i samma fack i 2D- eller 3D-format (organoider). Frånvaron av en botten i de 3D-printade insatserna möjliggör de vanliga odlingsförhållandena på plattan, möjlig beläggning på plattan som innehåller insatsen och direkt visualisering genom optisk mikroskopi. De många facken gör det möjligt att samla in olika celltyper oberoende av varandra eller att i varje fack använda olika reagenser för RNA- eller proteinextraktion. I denna studie ges en detaljerad metodik för att använda den nya 3D-printade insatsen som ett samodlingssystem. För att demonstrera flera kapaciteter hos denna flexibla och enkla modell utfördes tidigare publicerade funktionella analyser av cellkommunikation i de nya 3D-printade insatserna och visade sig vara reproducerbara. De 3D-printade insatserna och den konventionella cellodlingen med konditionerade medier ledde till liknande resultat. Sammanfattningsvis är den 3D-printade insatsen en enkel enhet som kan anpassas till många modeller av samkulturer med vidhäftande celltyper.

Introduction

In vivo kommunicerar cellerna med varandra antingen direkt (cellkontakt) eller indirekt (genom utsöndring av molekyler). För att studera cellkommunikation kan olika samodlingsmodeller utvecklas, såsom direkt samodling (de olika celltyperna är i direkt interaktion i samma brunn) och kompartmenterad samkultur (de olika celltyperna är i indirekt interaktion i olika delar av ett odlingssystem)¹. Dessutom kan konditionerade medier användas för samodlingssystem, där den indirekta interaktionen möjliggörs av att utsöndrade molekyler som finns i det konditionerade mediet av en effektorcelltyp överförs till en respondercelltyp¹.

När det gäller studier av parakrin cellkommunikation ger indirekta samodlingssystem modeller som starkt återspeglar cellinteraktioner in vivo. Indirekta samkultursystem har utvecklats och kommersialiserats, vilket har möjliggjort etablering av indirekta samkulturmodeller ^2,3. Tyvärr har de flesta indirekta samkultursystem bara två avdelningar. Andra indirekta samkultursystem tillhandahåller flera avdelningar, men de är mindre skalbara jämfört med det system som rapporteras i detta manuskript. Vissa av dem tillåter inte en klassisk visualisering under mikroskop, och de presenterar ofta specifika applikationsmetoder. I flera studier har den parakrina kommunikationen mellan olika celltyper undersökts med hjälp av den betingade mediemodellen 4,5,6,7. Detta är ett enklare sätt att undersöka jämfört med indirekta samkultursystem eftersom det inte kräver att specifika metoder eller material etableras¹. Å andra sidan är beredningen av konditionerade medier tidskrävande och ger endast information om envägscellsignalering (effektor till responder)¹.

I denna uppsats föreslås ett nytt, enkelt sätt att undersöka cellkommunikation. Genom att möjliggöra kombination av flera celltyper i direkt eller indirekt interaktion och i 2D- eller 3D-format, ger de tryckta insatserna många fördelar för att enkelt sätta upp samodlingsmodeller. Den 3D-printade insatsen är anpassad för att placeras i brunnarna på 6-brunnsplattor och är cirkulär och gör det möjligt att dela upp brunnen i fyra fack (två stora fack och två små fack; Figur 1A). De 3D-printade insatserna kännetecknas av frånvaron av en botten. Således är cellerna i direkt kontakt med plattan som insatsen är placerad på. Dessutom kan varje fack beläggas oberoende av de andra. Dessutom kan cellens beteende enkelt följas under optiska mikroskop. Närvaron av kommunikationsfönster i varje vägg i insatsen gör det möjligt att vid optimal tidpunkt lägga till ett gemensamt medium för att utföra olika experiment med samkultur. Ett flertal kombinationer av samodling kan utföras för att studera direkt och/eller indirekt kommunikation mellan flera celltyper. Till exempel kan en modell av indirekt samodling mellan fyra olika celltyper i monolager och/eller i 3D (sfäroider) utformas. En kombination av direkta och indirekta samodlingsmodeller kan också utföras genom att blanda olika celltyper i samma fack. Effekten av komplexa strukturer (organoider, vävnadsexplantat, etc.) på olika celltyper kan vara ett annat exempel på modeller som kan göras. Dessutom är de 3D-printade insatserna kompatibla med cellbiologiska funktionella analyser (proliferation, migration, pseudorörsbildning, differentiering, etc.) och med biokemiska tester (extraktion av DNA, RNA, protein, lipider, etc.). Slutligen ger de 3D-printade insatserna ett brett utbud av experimentella scheman av samodlingsmodeller med möjlighet att kombinera samtidigt olika analyser i samma experiment i de olika facken.

En del av kapaciteten hos de 3D-printade insatserna presenteras för att validera dem som en snabb och lättanvänd samodlingsmodell. I jämförelse med en tidigare publicerad studie utförd på parakrin cellkommunikation visas de 3D-printade inläggens förmåga att vara en värdefull samodlingsmodell. För att bedöma denna punkt jämfördes regleringen av endotelcellsproliferation och migration av keratinocyter mellan det 3D-printade insatssystemet och det klassiska systemet med konditionerade medier. De 3D-printade insatserna gör det möjligt att snabbt uppnå liknande resultat jämfört med det konventionella systemet med konditionerade medier. Faktum är att de 3D-printade insatserna ger en robust modell för att studera cellinteraktioner i båda riktningarna utan att behöva producera konditionerade medier och med möjlighet att parallellt utföra proliferations- och migrationsanalyserna i samma experiment.

Avslutningsvis föreslås i denna artikel en ny och färdig modell för att studera cellkommunikation. De 3D-printade insatserna är kompatibla med alla vidhäftande celltyper och gör det möjligt att utföra många kombinationer av samodling som syftar till att vara närmare in vivo-förhållanden .

Protocol

OBS: 3D-insatserna (Figur 1A) är kommersiellt anskaffade och skrivs ut med ett fotopolymerharts som är biokompatibelt med cellodling och autoklavering (se materialtabellen). I detta avsnitt beskrivs ett detaljerat protokoll för att upprätta samkulturmodellen med hjälp av insatser (se figur 1B). Några exempel på applikationer ges också. 1. Placering av den steriliserade insatsen i 6-hålsplattorna</strong…

Representative Results

I detta arbete beskrevs ett optimerat samkultursystem för att erhålla robusta, tillförlitliga och signifikanta data jämförbara med klassiska metoder genom användning av betingade medier. De 3D-printade insatserna efterliknar mikromiljöförhållandena in vivo hos olika celltyper i interaktion genom att övervinna svårigheterna och den tidskrävande produktionen av konditionerade medier uppströms i experimenten. En tidigare publicerad studie har genomförts på nytt för att analysera de indirekta interak…

Discussion

Indirekt cellkommunikation undersöks vanligen med hjälp av betingade medier eller samodlingssystem. Konditionerad medieberedning är tidskrävande uppströms i experimenten, och denna metod är begränsad till ensidiga effektanalyser. Den tidigare studien av Colin-Pierre et al.⁸ med hjälp av konditionerade medier utfördes på den indirekta cellkommunikationen mellan två celltyper (HDMEC och KORS). Data från denna tidigare studie visade effekten av KORS-konditionerade medier på HDME…

Materials

Autoclave	Getinge	APHP	Solid cycle, 121 °C for 20 min
Biomed Clear	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)
Cell culture detergents	Tounett	A18590/0116
Cell Proliferation Reagent WST-1	Roche	11,64,48,07,001
Counting slide	NanoEnTek	EVE-050
Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm	Ibidi	80206	two-migration chambers device.
Endothelial cell medium	ScienCell	1001	Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).
EVE Automated cell counter	NanoEnTek	NESCT-EVE-001E
EVOS XL Core	Fisher Scientific	AMEX1200	10x of magnification
Food silicon reagent and catalyst kit	Artificina	RTV 3428 A and B	(10:1)
FORM 3B printer	Formlabs	PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC	Impression performed by 3D-Morphoz company
Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)	ScienCell	2000
Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )	ScienCell	2420
Macro Wound Healing Tool Software	ImageJ		Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)
Mesenchymal stem cell medium	ScienCell	7501	Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)
Microplate reader SPECTRO star NANO	BMG Labtech		BMG LABTECH software
PBS	Promocell	C-40232	Without Ca2+ / Mg2+
Trypan Blue Stain	NanoEnTek	EBT-001
Trypsin / EDTA	Promocell	C-41020	Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature
96-well plate Nunclon Delta Surface	Thermoscientific	167008