JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Исследование взаимодействий между гистон-модифицирующими ферментами и факторами транскрипции in vivo путем флуоресцентного резонансного переноса энергии

Published: October 14, 2022
doi:
10.3791/64656
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Summary

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) – это метод визуализации для обнаружения белковых взаимодействий в живых клетках. Здесь представлен протокол FRET для изучения связи гистон-модифицирующих ферментов с факторами транскрипции, которые рекрутируют их в целевые промоторы для эпигенетической регуляции экспрессии генов в тканях растений.

Abstract

Эпигенетическая регуляция экспрессии генов обычно зависит от гистон-модифицирующих ферментов (HME), которые генерируют гетерохроматические или эухроматические гистоновые метки для транскрипционного подавления или активации соответственно. HME набираются к их целевому хроматину с помощью факторов транскрипции (TF). Таким образом, обнаружение и характеристика прямых взаимодействий между HME и TF имеют решающее значение для лучшего понимания их функции и специфичности. Эти исследования были бы более биологически значимыми, если бы выполнялись in vivo в живых тканях. Здесь описан протокол визуализации взаимодействий в листьях растений между растительной гистоновой деубиквитиназой и фактором транскрипции растений с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), что позволяет обнаруживать комплексы между белковыми молекулами, находящимися в пределах <10 нм друг от друга. Представлены две вариации методики FRET: SE-FRET (сенсибилизированное излучение) и AB-FRET (акцепторное отбеливание), при котором энергия передается без излучения от донора к акцептору или излучается излучительно донором при фотоотбеливании акцептора. Подходы SE-FRET и AB-FRET могут быть легко адаптированы для обнаружения других взаимодействий между другими белками в растениях.

Introduction

Деубиквитиназы растительного гистона играют важную роль в контроле экспрессии генов путем посттрансляционной модификации гистонов, в частности путем стирания их моноубиквитилирования1. До сих пор OTLD1 является одним из немногих растительных гистоновых деубиквитиназ, характеризующихся на молекулярном уровне в Arabidopsis 2,3. OTLD1 удаляет моноубиквитиновые группы из молекул гистонов H2B, тем самым способствуя удалению или добавлению эухроматического ацетилирования и метилирования модификаций гистонов H3 в гене-мишени хроматин 4,5. Кроме того, OTLD1 взаимодействует с другим хроматин-модифицирующим ферментом, гистон-лизиндеметилазой KDM1C, чтобы повлиять на транскрипционное подавление генов-мишеней 6,7.

Большинство гистон-модифицирующих ферментов не обладают способностями связывания ДНК и, следовательно, не могут распознавать свои гены-мишени напрямую. Одна из возможностей заключается в том, что они сотрудничают с ДНК-связывающими белками фактора транскрипции, которые связывают эти ферменты и направляют их к своим хроматиновым мишеням. В частности, в растениях несколько основных гистон-модифицирующих ферментов (т.е. гистонметилтрансферазы 8,9, гистоновые ацетилтрансферазы10, гистондеметилазы11 и поликомбные репрессивные комплексы 12,13,14), как известно, набираются факторами транскрипции. В соответствии с этой идеей недавно был предложен один возможный механизм рекрутирования OTLD1 к промоторам-мишеням, который основан на специфических белково-белковых взаимодействиях OTLD1 с фактором транскрипции LSH1015.

LSH10 принадлежит к семейству растительных белков ALOG (Arabidopsis LSH1 и Oryza G1), которые функционируют как центральные регуляторы развития 16,17,18,19,20,21,22. Тот факт, что члены семейства белков ALOG содержат мотивы связывания ДНК23 и демонстрируют способность к транскрипционной регуляции22, ядерной локализации19 и гомодимеризации24, дополнительно подтверждает представление о том, что эти белки, включая LSH10, могут действовать как специфические факторы транскрипции во время эпигенетической регуляции транскрипции. Одним из основных экспериментальных методов, используемых для характеристики взаимодействия LSH10-OTLD1 in vivo, является флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)15.

FRET – это метод визуализации для непосредственного обнаружения близких взаимодействий между белками в пределах <10 нм друг от друга25 внутри живых клеток. Существует два основных варианта подхода26 FRET: сенсибилизированное излучение (SE-FRET) (рисунок 1A) и акцепторное отбеливание (AB-FRET) (рисунок 1B). В SE-FRET взаимодействующие белки, один из которых помечен донорским фторхромом (например, зеленым флуоресцентным белком, GFP), а другой акцепторным фторхромом (например, мономерным красным флуоресцентным белком, mRFP 27,28), нерадиятивно передают энергию возбужденного состояния от донора к акцептору. Поскольку во время этой передачи не испускаются фотоны, создается флуоресцентный сигнал, который имеет спектр радиационного излучения, аналогичный спектру акцептора. В AB-FRET белковые взаимодействия обнаруживаются и количественно оцениваются на основе повышенного радиационного излучения донора, когда акцептор постоянно инактивируется фотоотбеливанием и, таким образом, не может получать нерадиационную энергию, передаваемую от донора (рисунок 1). Важно отметить, что субклеточное расположение флуоресценции FRET свидетельствует о локализации взаимодействующих белков в клетке.

Способность развертывать FRET в живых тканях и определять субклеточную локализацию взаимодействующих белков одновременно с обнаружением этого взаимодействия как такового, делает FRET методом выбора для исследований и начальной характеристики белково-белковых взаимодействий in vivo. Сопоставимая методология флуоресцентной визуализации in vivo, бимолекулярная флуоресцентная комплементация (BiFC)29,30,31,32, является хорошим альтернативным подходом, хотя, в отличие от FRET, BiFC может производить ложные срабатывания из-за спонтанной сборки автофлуоресцентных репортеров BiFC33, и количественная оценка его данных менее точна.

В данной статье рассказывается об успешном опыте внедрения методов SE-FRET и AB-FRET и представлен протокол их развертывания для исследования взаимодействий между OTLD1 и LSH10 в растительных клетках.

Protocol

Для настоящего исследования использовались штамм Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens EHA105 или GV3101. 1. Построение вектора FRET Выберите флуоресцентные метки для пары донор/акцептор FRET.Используйте EGFP из pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (см. <st…

Representative Results

Рисунок 2 иллюстрирует типичные результаты эксперимента SE-FRET, в котором ядра клеток были одновременно записаны в трех каналах (т.е. донорский GFP, акцепторный mRFP и SE-FRET). Эти данные были использованы для создания изображений эффективности SE-FRET, закодированных в псевдоцветн…

Discussion

Этот протокол FRET прост и легко воспроизводится; он также требует минимальных инвестиций в поставки и использует стандартное оборудование для многих современных лабораторий. В частности, пять основных технических особенностей отличают универсальность этой процедуры. Во-первых, конст?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа в лаборатории V.C. поддерживается грантами NIH (R35GM144059 и R01GM50224), NSF (MCB1913165 и IOS1758046) и BARD (IS-5276-20) для V.C.

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Biologia Molecular. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S., Hartley, D. A. . Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. , 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

FRETProtein-protein InteractionAgroinfiltrationNicotiana BenthamianaHistone Modifying EnzymesTranscription FactorsLiving CellFluorescence Resonance Energy Transfer
check_url/pt/64656?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image