JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Undersöka interaktioner mellan histonmodifierande enzymer och transkriptionsfaktorer in vivo genom fluorescensresonansenergiöverföring

Published: October 14, 2022
doi:
10.3791/64656
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Summary

Fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) är en avbildningsteknik för att detektera proteininteraktioner i levande celler. Här presenteras ett FRET-protokoll för att studera sambandet mellan histonmodifierande enzymer och transkriptionsfaktorer som rekryterar dem till målpromotorerna för epigenetisk reglering av genuttryck i växtvävnader.

Abstract

Epigenetisk reglering av genuttryck påverkas vanligtvis av histonmodifierande enzymer (HME) som genererar heterokromatiska eller eukromatiska histonmärken för transkriptionell repression respektive aktivering. HME rekryteras till sitt målkromatin genom transkriptionsfaktorer (TF). Således är detektion och karakterisering av direkta interaktioner mellan HME och TF avgörande för att förstå deras funktion och specificitet bättre. Dessa studier skulle vara mer biologiskt relevanta om de utfördes in vivo i levande vävnader. Här beskrivs ett protokoll för att visualisera interaktioner i växtblad mellan ett växthistondeubiquitinas och en växttranskriptionsfaktor med hjälp av fluorescensresonansenergiöverföring (FRET), vilket möjliggör detektering av komplex mellan proteinmolekyler som ligger inom < 10 nm från varandra. Två varianter av FRET-tekniken presenteras: SE-FRET (sensibiliserad emission) och AB-FRET (acceptorblekning), där energin överförs icke-radiativt från givaren till acceptorn eller avges strålande av givaren vid fotoblekning av acceptorn. Både SE-FRET- och AB-FRET-metoder kan enkelt anpassas för att upptäcka andra interaktioner mellan andra proteiner i planta.

Introduction

Växthiston deubiquitinaser spelar en viktig roll för att kontrollera genuttryck genom post-translationell modifiering av histoner, särskilt genom att radera deras monoubiquitylationsmärken1. Hittills är OTLD1 en av de få växthistondeubiquitinaser som karakteriseras på molekylär nivå i Arabidopsis 2,3. OTLD1 avlägsnar monoubiquitingrupper från H2B-histonmolekylerna och främjar därigenom avlägsnande eller tillsats av eukromatisk acetylering och metyleringsmodifieringar av H3-histoner i målgenenkromatin 4,5. Dessutom interagerar OTLD1 med ett annat kromatinmodifierande enzym, histonlysindemetylas KDM1C, för att påverka transkriptionell undertryckning av målgenerna 6,7.

De flesta histonmodifierande enzymer saknar DNA-bindningsförmåga och kan därför inte känna igen sina målgener direkt. En möjlighet är att de samarbetar med DNA-bindande transkriptionsfaktorproteiner som binder dessa enzymer och leder dem till deras kromatinmål. Specifikt, i växter, är flera stora histonmodifierande enzymer (dvs. histonmetyltransferaser 8,9, histonacetyltransferaser 10, histondemetylaser 11 och polykombrepressiva komplex12,13,14) kända för att rekryteras av transkriptionsfaktorer. I överensstämmelse med denna idé föreslogs nyligen en möjlig mekanism för OTLD1-rekrytering till målpromotorerna som är baserad på specifika protein-proteininteraktioner av OTLD1 med en transkriptionsfaktor LSH1015.

LSH10 tillhör en familj av växten ALOG (Arabidopsis LSH1 och Oryza G1) proteiner som fungerar som centrala utvecklingsregulatorer 16,17,18,19,20,21,22. Det faktum att medlemmarna i ALOG-proteinfamiljen innehåller DNA-bindande motiv23 och uppvisar kapacitet för transkriptionell reglering 22, kärnlokalisering19 och homodimerisering24 ger ytterligare stöd för uppfattningen att dessa proteiner, inklusive LSH10, kan fungera som specifika transkriptionsfaktorer under epigenetisk reglering av transkription. En av de viktigaste experimentella teknikerna som används för att karakterisera LSH10-OTLD1-interaktionen in vivo är fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)15.

FRET är en avbildningsteknik för att direkt detektera interaktioner på nära håll mellan proteiner inom <10 nm från varandra25 inuti levande celler. Det finns två huvudsakliga varianter av FRET-metoden26: sensibiliserad emission (SE-FRET) (figur 1A) och acceptorblekning (AB-FRET) (figur 1B). I SE-FRET är de interagerande proteinerna märkta med en donatorfluorokr (t.ex. grönt fluorescerande protein, GFP) och det andra med en acceptorfluorokr (t.ex. monomert rött fluorescerande protein, mRFP27,28) – överför icke-radiativt den exciterade tillståndsenergin från givaren till acceptorn. Eftersom inga fotoner emitteras under denna överföring produceras en fluorescerande signal som har ett strålningsemissionsspektrum som liknar acceptorns. I AB-FRET detekteras och kvantifieras proteininteraktioner baserat på förhöjd strålningsemission från givaren när acceptorn inaktiveras permanent genom fotoblekning och därmed inte kan ta emot den icke-strålningsenergi som överförs från givaren (figur 1). Det är viktigt att den subcellulära platsen för FRET-fluorescensen indikerar lokaliseringen av de interagerande proteinerna i cellen.

Förmågan att distribuera FRET i levande vävnader och bestämma den subcellulära lokaliseringen av de interagerande proteinerna samtidigt med att detektera denna interaktion i sig, gör FRET till den valda tekniken för studier och initial karakterisering av protein-proteininteraktioner in vivo. En jämförbar in vivo-metod för fluorescensavbildning, bimolekylär fluorescenskomplementering (BiFC)29,30,31,32, är ett bra alternativt tillvägagångssätt, även om BiFC, till skillnad från FRET, kan producera falska positiva resultat på grund av spontan montering av de autofluorescerande BiFC-reportrarna 33, och kvantifieringen av dess data är mindre exakt.

Den här artikeln delar den framgångsrika erfarenheten av att implementera både SE-FRET- och AB-FRET-tekniker och presenterar ett protokoll för deras distribution för att undersöka interaktionerna mellan OTLD1 och LSH10 i växtceller.

Protocol

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens stam EHA105 eller GV3101 användes för denna studie. 1. FRET vektor konstruktion Välj fluorescerande taggar för FRET-paret för givare/acceptor.Använd EGFP från pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (se materialförteckning) för att generera givarvektorn. Använd mRFP från pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (se m…

Representative Results

Figur 2 illustrerar de typiska resultaten av ett SE-FRET-experiment, där cellkärnorna samtidigt registrerades i tre kanaler (dvs. donator GFP, acceptor mRFP och SE-FRET). Dessa data användes för att generera bilder av SE-FRET-effektivitet kodade i en pseudofärgskala. På denna skala motsvarar övergången från blått till rött en ökning av FRET-effektiviteten, ett mått på protein-proteinnärhet från 0% till 100%. I detta representativa experiment registrerades SE-FRET-signalen i c…

Discussion

Detta FRET-protokoll är enkelt och lätt att reproducera; Det kräver också minimala leveransinvesteringar och använder standardutrustning för många moderna laboratorier. Specifikt skiljer fem huvudsakliga tekniska egenskaper mångsidigheten i denna procedur. För det första genereras FRET-konstruktionerna med hjälp av platsspecifik rekombination, en kloningsmetod som är enkel att använda, ger exakta resultat och sparar tid jämfört med traditionell restriktionsenzymbaserad kloning. För det andra är N. be…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Arbetet i V.C.:s laboratorium stöds av bidrag från NIH (R35GM144059 och R01GM50224), NSF (MCB1913165 och IOS1758046) och BARD (IS-5276-20) till V.C.

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Biologia Molecular. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S., Hartley, D. A. . Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. , 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

FRETProtein-protein InteractionAgroinfiltrationNicotiana BenthamianaHistone Modifying EnzymesTranscription FactorsLiving CellFluorescence Resonance Energy Transfer
check_url/pt/64656?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image