Ici, un protocole pour la mise en œuvre de la microscopie d’expansion dans les embryons précoces de drosophile afin d’obtenir une imagerie à super-résolution à l’aide d’un microscope confocal conventionnel à balayage laser est présenté.
Le cheval de bataille de la biologie du développement est le microscope confocal, qui permet aux chercheurs de déterminer la localisation tridimensionnelle des molécules marquées dans des échantillons biologiques complexes. Alors que les microscopes confocaux traditionnels permettent de résoudre deux sources ponctuelles fluorescentes adjacentes situées à quelques centaines de nanomètres l’une de l’autre, l’observation des détails les plus fins de la biologie subcellulaire nécessite la capacité de résoudre des signaux de l’ordre de quelques dizaines de nanomètres. De nombreuses méthodes matérielles de microscopie à super-résolution ont été mises au point pour permettre aux chercheurs de contourner ces limites de résolution, bien que ces méthodes nécessitent des microscopes spécialisés qui ne sont pas disponibles pour tous les chercheurs. Une méthode alternative pour augmenter le pouvoir de résolution consiste à agrandir isotropement l’échantillon lui-même par un processus connu sous le nom de microscopie à expansion (ExM), qui a été décrit pour la première fois par le groupe de Boyden en 2015. L’ExM n’est pas un type de microscopie en soi, mais plutôt une méthode de gonflement d’un échantillon tout pt préservant l’organisation spatiale relative de ses molécules constitutives. L’échantillon élargi peut ensuite être observé à une résolution effectivement augmentée à l’aide d’un microscope confocal traditionnel. Ici, nous décrivons un protocole pour la mise en œuvre de l’ExM dans les embryons de drosophile montés entiers, qui est utilisé pour examiner la localisation de Par-3, de la myosine II et des mitochondries dans les cellules épithéliales de surface. Ce protocole permet de multiplier par quatre la taille de l’échantillon, ce qui permet de détecter des détails subcellulaires qui ne sont pas visibles avec la microscopie confocale conventionnelle. Comme preuve de principe, un anticorps anti-GFP est utilisé pour distinguer des pools distincts de myosine-GFP entre les cortex cellulaires adjacents, et la streptavidine marquée par fluorescence est utilisée pour détecter les molécules biotinylées endogènes afin de révéler les détails fins de l’architecture du réseau mitochondrial. Ce protocole utilise des anticorps et des réactifs courants pour le marquage par fluorescence, et il devrait être compatible avec de nombreux protocoles d’immunofluorescence existants.
En biologie cellulaire et du développement, il faut le voir pour le croire, et la capacité de déterminer avec précision les modèles de localisation des protéines est fondamentale pour de nombreux types d’expériences. La microscopie confocale à balayage laser est l’outil standard pour l’imagerie de protéines marquées par fluorescence en trois dimensions dans des échantillons intacts. Les microscopes confocaux conventionnels sont incapables de distinguer (résoudre) les signaux fluorescents adjacents qui sont séparés par moins de la moitié de la longueur d’onde de la lumière qu’ils émettent1. En d’autres termes, deux sources ponctuelles doivent être séparées d’au moins 200 à 300 nm dans la direction latérale (500 à 700 nm dans la direction axiale) pour les résoudre comme deux signaux distincts. Cette barrière technique est connue sous le nom de limite de diffraction, et c’est un obstacle fondamental à l’étude des structures subcellulaires complexes (par exemple, les réseaux cytosquelettiques ou mitochondriaux de l’actomyosine) avec des caractéristiques spatiales inférieures à la limite de diffraction. Par conséquent, les techniques permettant d’augmenter le pouvoir de résolution des microscopes confocaux conventionnels présentent un intérêt général pour la communauté biologique.
Pour contourner la limite de diffraction, un certain nombre de technologies de microscopie à super-résolution ont été développées qui permettent une résolution de l’ordre de quelques dizaines de nanomètres ou moins 1,2,3, révélant un monde de complexité biologique qui n’était auparavant accessible que par microscopie électronique. Malgré les avantages évidents de ces méthodes matérielles, les microscopes à super-résolution ont souvent des exigences spécifiques en matière d’étiquetage des échantillons et de longs temps d’acquisition, ce qui limite leur flexibilité, ou ils peuvent tout simplement être trop coûteux pour certains laboratoires. Une alternative à la super-résolution au microscope est la microscopie d’expansion (ExM), qui n’est pas un type de microscopie en soi, mais plutôt une méthode de gonflement d’un échantillon tout pt préservant l’organisation spatiale relative de ses molécules constitutives4. Les échantillons élargis isotropement peuvent ensuite être observés à une résolution effectivement augmentée à l’aide d’un microscope confocal à fluorescence traditionnel. L’ExM a été décrite pour la première fois par le groupe de Boyden en 20155, et la technique de base a depuis été adaptée pour être utilisée dans une variété d’expériences 6,7,8. ExM a également été adapté pour être utilisé dans des embryons entiers, notamment chez la drosophile9, 10, 11, C. elegans12 et le poisson-zèbre 13, ce qui en fait un outil puissant pour les biologistes du développement.
ExM est basé sur deux chimies d’hydrogel différentes : 1) les hydrogels polyélectrolytiques gonflables, qui augmentent considérablement en taille lorsqu’ils sont trempés dans l’eau14, et 2) les hydrogels de polyacrylamide, qui ont un espacement extrêmement faible entre les polymères pour permettre une expansion isotrope de l’échantillon15. Bien qu’il existe de nombreux protocoles ExM publiés, ils partagent généralement les étapes suivantes : fixation de l’échantillon, étiquetage, activation, gélification, digestion et expansion4. Les conditions de fixation et les stratégies de marquage par fluorescence varient bien sûr en fonction des besoins de l’expérience et du système, et dans certains protocoles, le marquage se produit après l’expansion. Les molécules cibles de l’échantillon doivent être amorcées (activées) pour se lier à l’hydrogel, ce qui peut être réalisé en utilisant différentes chimies4. Au cours des étapes de gélification, l’échantillon est saturé de monomères du futur hydrogel (acrylate de sodium, acrylamide et bisacrylamide, réticulant), et l’hydrogel est ensuite formé par polymérisation radicalaire catalysée par un initiateur, tel que le persulfate d’ammonium (APS), et un accélérateur, tel que la tétraméthylènediamine (TEMED)4. Après gélification, l’échantillon est digéré enzymatiquement pour homogénéiser la résistance de l’échantillon au gonflement et assurer l’expansion isotrope de l’hydrogel4. Enfin, l’hydrogel digéré est placé dans l’eau, ce qui le fait se dilater jusqu’à environ quatre fois sa taille linéaire d’origine4.
Figure 1 : Vue d’ensemble de la microscopie d’expansion chez les embryons de drosophile. ExM est un protocole en plusieurs étapes qui prend au moins 4 jours à compléter. Le prélèvement, la fixation et la désensilinisation des embryons prennent 1 jour ou plus selon que les embryons provenant de plusieurs collections sont mis en commun ou non. Le marquage par immunofluorescence prend 1 jour ou 2 jours selon que les embryons sont incubés pendant la nuit avec les anticorps primaires. L’activation, la gélification, la digestion et l’expansion de l’embryon peuvent être effectuées en une seule journée. Les gels peuvent être montés et imagés immédiatement après l’expansion, bien que pour des raisons pratiques, il soit souvent souhaitable de commencer l’imagerie le lendemain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ce protocole décrit comment effectuer l’ExM sur des embryons de drosophile à un stade précoce ou intermédiaire16 afin de visualiser les modèles de localisation des protéines subcellulaires à super-résolution (Figure 1). Cette méthode utilise la chimie de l’ester N-hydroxysuccinimidyle de l’acide méthylacrylique (MA-NHS) pour activer et ancrer les molécules de protéines à l’hydrogel17, et il s’agit d’une modification d’un protocole ExM précédemment publié pour une utilisation dans les embryons et les tissus de drosophile à un stade avancé11. Ce protocole utilise des puits de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour mouler les hydrogels et faciliter l’échange de solutions lors de l’activation et de la gélification. Une autre méthode qui ne nécessite pas la création de puits PDMS consiste à abaisser les embryons attachés à des lamelles dans des gouttes de solution monomère posées sur un morceau de film d’étanchéité de laboratoire22. De plus, ce protocole décrit une méthode permettant d’enlever manuellement la membrane vittelline imperméable qui entoure les embryons de drosophile , ce qui est une condition préalable à la coloration par immunofluorescence. Il est important de noter que cette méthode d’épluchage manuel des embryons peut être utilisée pour sélectionner uniquement les embryons de drosophile correctement stadifiés avant l’étiquetage des échantillons, ce qui augmente considérablement la probabilité de se retrouver avec des échantillons élargis du stade et de l’orientation corrects et, par conséquent, rend la collecte de données en aval beaucoup plus efficace.
Dévitellinisation manuelle
La plupart des protocoles de fixation d’embryons de drosophile impliquent l’ablation de la membrane vitelline en agitant les embryons fixés dans une émulsion de méthanol et d’heptane, ce qui provoque l’éclatement des membranes par rupture osmotique26. Alors que la désensitinisation à base de méthanol (éclatement du méthanol) est efficace et appropriée pour de nombreuses applications, la dédésensilinisation manuelle (épluchage à la main) offre des avantages significatifs. Tout d’abord, l’épluchage à la main permet de choisir des embryons au stade précis de la devitellinisation et de la collecte, ce qui augmente considérablement la probabilité d’obtenir des embryons élargis dans une orientation utilisable à la fin de l’expérience. Cet enrichissement est essentiel lors de l’étude d’aspects spécifiques des processus de développement rapide (par exemple, l’invagination du mésoderme ou l’extension convergente), pour lesquels les embryons stadifiés de manière appropriée peuvent ne représenter que quelques pour cent de tous les embryons, même dans une fenêtre de collecte très serrée. Bien sûr, pour de nombreuses applications, l’éclatement plus traditionnel au méthanol d’embryons à partir d’une fenêtre de collecte chronométrée sera suffisant, et l’épluchage à la main peut ne pas valoir l’effort supplémentaire. Deuxièmement, la liaison de certains anticorps primaires et colorants est affectée négativement par l’exposition antérieure de l’échantillon au méthanol. Pour cette raison, le peeling à la main peut entraîner des augmentations significatives de la qualité du signal d’immunofluorescence par rapport aux échantillons de méthanol, ce qui en fait une technique générale utile pour les biologistes du développement de la drosophile .
Microscopie confocale à haute résolution dans des embryons de drosophile à montage entier expansé
Bien que l’exécution de la microscopie confocale à haute résolution sur des échantillons élargis soit conceptuellement la même que sur des échantillons non étendus, ExM présente certains obstacles techniques. Notamment, l’orientation de l’embryon, qui est aléatoire, devient encore plus importante à mesure que la taille de l’échantillon augmente, car les objectifs à fort grossissement et à NA élevé ne sont capables de focaliser la lumière qu’à partir de régions d’échantillon très proches de la lamelle27. Par conséquent, il n’est généralement possible de se concentrer que sur les cellules situées à la surface ou près de la surface de l’embryon qui se sont retrouvées adjacentes à la lamelle lors de la formation du gel. La meilleure façon de s’assurer qu’il y a des spécimens de la bonne orientation à la fin est de commencer le protocole ExM avec une collection d’embryons fixes par étapes serrées (par exemple, en utilisant l’épluchage à la main) et d’ensemencer de nombreux embryons dans chaque puits (>10). Pour visualiser les cellules situées profondément à l’intérieur de l’embryon, il peut être nécessaire d’utiliser des dispositifs d’imagerie plus spécialisés, tels que la microscopie à feuille de lumière28. De plus, nous constatons que la qualité de l’image peut être améliorée en ouvrant le sténopé confocal à une taille supérieure à une unité aérée. Bien sûr, une augmentation de la taille du sténopé se fera au prix d’une diminution de la résolution maximale, mais dans la pratique, même de petites augmentations de la taille du sténopé peuvent augmenter considérablement l’intensité du signal (données non présentées). Les études futures devraient systématiquement porter sur la taille des trous d’épingle et la résolution effective dans les échantillons ExM.
Variations sur ExM de base
Le protocole décrit ici est un exemple relativement simple d’ExM qui devrait fonctionner pour de nombreuses applications et être facile à mettre en œuvre dans la plupart des laboratoires de biologie du développement. Cependant, il existe de nombreuses variantes du concept de base d’ExM 4,5,7 qui peuvent être utilisées pour augmenter l’intensité du signal, atteindre des degrés d’expansion encore plus élevés et détecter des molécules d’acide nucléique ainsi que des protéines. Dans ce protocole, les embryons sont incubés avec des anticorps avant la gélification et l’expansion. Alternativement, les échantillons peuvent être traités avec des anticorps après leur expansion 6,30, ce qui peut augmenter l’intensité du signal en raison de l’accessibilité accrue des épitopes et de la diminution de la perte d’anticorps liés pendant les étapes d’expansion. De plus, des molécules de réticulation spécifiques peuvent être utilisées pour attacher des molécules d’ARN à l’hydrogel afin de permettre la détection de l’ARN dans les gels expansés en utilisant la méthode de réaction en chaîne d’hybridation30. Enfin, les échantillons peuvent être soumis à plusieurs cycles d’expansion, comme dans la microscopie d’expansion itérative (iExM)31, la microscopie pan-ExM32 et la révélatrice d’expansion (ExR)31, pour atteindre des degrés encore plus élevés de résolution accrue.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier la Dre Jennifer Zallen d’avoir fourni l’anticorps primaire anti-Par-3 du cobaye. Ces travaux ont été soutenus par un généreux financement (1R15GM143729-01 et 1P20GM139768-01 5743) de l’Institut national des sciences médicales générales (NIGMS), l’un des membres des National Institutes of Health (NIH), ainsi que de l’Arkansas Biosciences Institute (ABI), qui a fourni un financement partiel pour l’achat de notre microscope confocal.
acrylamide | Milipore Sigma | 1490-100ML | |
ammonium persulfate | VWR | BDH9214-500G | |
anti-GFP rabbit polyclonal antibody | Torrey Pines BioLabs | TP-401 | |
anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11075 | |
anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
bisacrylamide | Research Products International | A11275 | |
bovine serum albumin (30% solution) | Millipore Sigma | A7284 | |
conical tubes, 50 mL | fisherscientific | 21008-940 | |
coverlip glass, square 22 mm | VWR | 48366-227 | |
coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm | VWR | 48393-230 | |
glass capillaries for pulling needles | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
glass microinjection needles (pre-pulled) | World Precision Instruments | TIP10LT | |
guanidine HCl | VWR | 101970-606 | |
heptane | VWR | EM-HX0078-1 | |
latex pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester | VWR | 730300-1G | |
microfuge tube, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
multi-well plate, 6-well | Genesee | 25-100 | |
paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) | Electron Microscopy Sciences | 509804487 (Fisher) | |
Pasteur pipet (2 mL, short tip) | VWR | 14673-010 | |
PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) | VWR | 102092-312 | |
Petri plates | Genesee | 32-107 | |
phosphate-buffered saline (10x solution) | VWR | 97063-660 | |
Poly-L-lysine solution (0.1% solution) | VWR | P8920-1ooML | |
Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | E00491 | |
scintillation vials (30 mL) | VWR | 66022-128 | |
sodium acrylate | VWR | 101181-226 | |
sodium azide (powder) | Millipore Sigma | 71289 | make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration! |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | S32354 | |
TAE (50x) | VWR | 97063-692 | |
tape (double-sided, 1 inch wide) | Scotch 3M | 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed | |
TEMED | Thermo Fisher Scientific | PI17919 | |
TEMPO | VWR | EM8.14681.0005 | catalytic oxidant |
Tween-20 | VWR | 97063-872 | extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water |
Zeiss LSM 900 | Zeiss | Laser scanning microscope used without AiryScan |