Rilevamento di cellule T polifunzionali in bambini vaccinati con vaccino contro l'encefalite giapponese tramite la tecnica della citometria a flusso

Summary

Il presente protocollo combina la stimolazione ex vivo e la citometria a flusso per analizzare i profili delle cellule T polifunzionali (T PF) nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC₎ all’interno di bambini vaccinati con virus dell’encefalite giapponese (JEV). Il metodo di rilevazione e lo schema di colori della citometria a flusso dei TPF specifici di JEV sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.

Abstract

L’immunità mediata dalle cellule T svolge un ruolo importante nel controllo dell’infezione da flavivirus, sia dopo la vaccinazione che dopo l’infezione naturale. La “qualità” di una cellula T deve essere valutata per funzione e una funzione più elevata è associata a una protezione immunitaria più potente. Le cellule T che possono produrre simultaneamente due o più citochine o chemochine a livello di singola cellula sono chiamate cellule T polifunzionali (T_PFs), che mediano le risposte immunitarie attraverso una varietà di meccanismi molecolari per esprimere marcatori di degranulazione (CD107a) e secernere interferone (IFN)-γ, fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, interleuchina (IL)-2 o proteina infiammatoria dei macrofagi (MIP)-1α. Vi è una crescente evidenza che le T_PFsono strettamente correlate al mantenimento della memoria immunitaria a lungo termine e alla protezione e che la loro maggiore proporzione è un importante marker di immunità protettiva ed è importante nel controllo efficace dell’infezione virale e della riattivazione. Questa valutazione si applica non solo a specifiche risposte immunitarie, ma anche alla valutazione delle risposte immunitarie cross-reattive. Qui, prendendo come esempio il virus dell’encefalite giapponese (JEV), il metodo di rilevamento e lo schema di colori della citometria a flusso_{dei PF T}specifici di JEV prodotti dalle cellule mononucleate del sangue periferico di bambini vaccinati contro l’encefalite giapponese sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.

Introduction

Il virus dell’encefalite giapponese (JEV) è un importante virus trasmesso dalle zanzare appartenente al genere Flavivirus all’interno della famiglia Flaviviridae¹. Molti paesi dell’Asia-Pacifico hanno affrontato a lungo enormi sfide per la salute pubblica a causa dell’enorme carico di malattia causato dall’encefalite giapponese (JE), ma questo è migliorato notevolmente con la crescente disponibilità di vari tipi di vaccinazioni². Le risposte immunitarie protettive adattative evocate dall’infezione naturale o dalla vaccinazione contribuiscono alla prevenzione e alla regolazione antivirale. L’immunità umorale e l’immunità cellulo-mediata sono classificate come immunità adattativa e l’induzione della prima è sempre stata considerata una strategia chiave nella progettazione di vaccini, sebbene con una comprensione relativamente limitata negli ultimi³. Tuttavia, il ruolo dell’immunità mediata dalle cellule T nel limitare la diffusione del flavivirus e la clearance del virus è stato sempre più focalizzato e ampiamente studiato⁴. Inoltre, l’immunità delle cellule T non è solo indispensabile nelle risposte antivirali specifiche per JEV, ma svolge anche un ruolo di primo piano nella protezione incrociata dall’infezione secondaria con flavivirus eterologhi, che è stato dimostrato in studi precedenti⁵. Si ipotizza che questo effetto possa bypassare potenziali effetti di potenziamento mediati da anticorpi nell’infezione⁵. Da notare, tale immunità delle cellule T cross-reattive è importante, specialmente in assenza di vaccini e farmaci antivirali contro i flavivirus. Sebbene siano stati condotti molti studi per determinare il contributo delle cellule T nell’infezione da JEV rispetto alle cellule T CD4+ e CD8^{+ 6,7}, le rispettive linee che secernono citochine e la loro diversificazione funzionale rimangono indeterminate^, il che significa che la delucidazione delle esatte funzioni delle cellule T helper e killer è ostacolata.

La scala delle loro difese antivirali determina la qualità delle risposte delle cellule T. Le cellule T CD4+ o CD8⁺ che possono conferire compatibilmente due o più funzioni, tra cui la secrezione e la degranulazione delle citochine, sono caratterizzate come cellule T polifunzionali (T_PFs) dopo stimolazione specifica^{a livello 8} di singola cellula. Le cellule T CD4 ⁺ che producono citochine singole o multiple possono avere vari effetti e memorie immunitarie. Ad esempio, le cellule T IL-2+ IFN-γ⁺ CD4+ hanno maggiori probabilità di formare una risposta protettiva efficace a lungo termine rispetto alle cellule T IL-2+ CD4⁺ 9, che possono essere utilizzate come parametro importante nella valutazione dell’effetto della vaccinazione. La frequenza delle cellule T IL-2+ IFN-γ⁺ CD4+ è aumentata nei pazienti con non-progressione a lungo termine della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), mentre le cellule T CD4⁺ nei pazienti con progressione dell’AIDS sono più inclini a produrre IFN-γ da solo a causa dell’effetto promotore di IL-2 sulla proliferazione delle cellule T¹⁰. Inoltre, un sottogruppo di IL-2⁺ IFN-γ+ TNF-α⁺ ha dimostrato di sopravvivere a lungo termine in vivo e promuovere sinergicamente la funzione di uccisione¹¹. Sebbene le cellule T CD8+ abbiano maggiori probabilità di mostrare attività citotossica, alcune cellule T CD4⁺ sono anche dotate di attività citotossica come espressione rilevata indirettamente delle molecole di superficie CD107a¹². Inoltre, alcuni sottogruppi di cellule T esprimono la chemochina MIP-1α, che è spesso secreta dai monociti per partecipare al reclutamento dei neutrofili mediato dalle cellule T¹³. Allo stesso modo, CD8⁺ T_PFs può anche essere utilizzato per caratterizzare la versatilità dei marcatori di cui sopra. Gli studi hanno dimostrato che la strategia prime-boost può effettivamente indurre un periodo prolungato di effetti protettivi T_PF ¹³, che possono migliorare la protezione suscitata dalla vaccinazione. Una caratteristica centrale nell’esame del sistema immunitario è la capacità delle cellule T di memoria di facilitare risposte più forti, più veloci e più efficaci alle sfide virali secondarie rispetto alle cellule T naïve. Le cellule T della memoria effettrice (T_EM) e le cellule T della memoria centrale (T_CM) sono importanti sottoinsiemi di cellule T che sono spesso differenziate dall’espressione composita di CD27/CD45RO o CCR7/CD45RA¹⁴. La T_CM (CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA-) tende a localizzarsi nei tessuti linfoidi secondari, mentre la T_EM (CD27- CD45RO⁺ o CCR7^– CD45RA^–) si localizza nei tessuti linfoidi e periferici^15,16. T_EM fornisce una difesa immediata ma non sostenuta, mentre T_CM sostiene la risposta proliferando negli organi linfoidi secondari e generando nuovi effettori¹⁷. Pertanto, dato che le cellule di memoria possono mediare risposte di richiamo specifiche ed efficienti ai virus, sorgono domande sul contributo di questo sottoinsieme di polifunzioni.

Con lo sviluppo della tecnologia di citometria a flusso, è diventato comune rilevare simultaneamente marcatori di oltre 10 cluster, fenotipi e antigeni di differenziazione, il che è utile per annotare più abbondantemente le caratteristiche immunologiche funzionali sulle singole cellule T per ridurre l’interpretazione errata e le difficoltà nella comprensione dei fenotipi delle cellule T. Questo studio ha utilizzato la stimolazione ex vivo e la citometria a flusso per analizzare i profili T_PF nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) all’interno di bambini vaccinati con JEV. Applicando questo approccio, verrà ampliata la comprensione dell’immunità delle cellule T JEV-specifica e persino cross-reattiva a breve e lungo termine indotta dalla vaccinazione.

Protocol

L’approvazione etica per il presente studio è stata ottenuta dal Comitato etico dell’ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University (numero di approvazione: 2020-k-85). I volontari sono stati reclutati dall’ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University. I campioni di sangue venoso periferico sono stati ottenuti da bambini apparentemente sani (2 anni) che avevano precedentemente ricevuto una vaccinazione primaria e potenziata con vaccino JE SA14-14-2 vivo attenuato per meno di sei mesi (bambini v…

Representative Results

La Figura 1 mostra la strategia di gating utilizzata per dividere la TCM o TEM delle cellule T CD8+ o CD4+ da un gruppo rappresentativo di stimolazione JEV di bambini vaccinati con JE. Il dot plot FSC-A/SSC-A viene utilizzato per identificare i linfociti e il dot plot FSC-A/FSC-W viene utilizzato per identificare singole cellule. Le celle vitali vengono selezionate sul dot plot vivo/morto/SSC-A. Il dot plot CD3/SSC-A viene utilizzato per identifica…

Discussion

Questo protocollo rappresenta un metodo di rilevazione fattibile basato sulla citometria a flusso per i profili T_PF nelle PBMC di bambini vaccinati con il vaccino JEV SA14-14-2. Questo studio ha utilizzato le PBMC del sangue venoso di bambini vaccinati e non vaccinati come materiali di ricerca. Con la stimolazione delle PBMC con l’antigene JEV, quelle_{PF T}amplificate antigene-specifiche possono essere caratterizzate dalla colorazione anticorpale con citometria a flusso multicolore. Rispetto al metodo…

Materials

anti-human CD28	Biolegend	302934	Antibody
anti-human CD49d	Biolegend	304339	Antibody
APC anti-human MIP-1α	BD	551533	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSymphony A5	BD	A5	flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4	BD	563550	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CCR7	BD	741786	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CD27	BD	612829	Fluorescent antibody
BV421 anti-human CD8	Biolegend	344748	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RA	BD	566114	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RO	BD	566143	Fluorescent antibody
BV605 anti-human CD107a	Biolegend	328634	Fluorescent antibody
BV650 anti-human CD3	BD	563999	Fluorescent antibody
BV785 anti-human IL-2	Biolegend	500348	Fluorescent antibody
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714	Cell fixation and permeabilization
Density gradient medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γ	Biolegend	502506	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	22400089	cell culture medium
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-α	Biolegend	502909	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)	BD	555029	blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD	554724	blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability Dye	Biolegend	423106	Dead cell stain