Japon Ensefalit Aşısı ile Aşılanan Çocuklarda Çok Fonksiyonlu T Hücrelerinin Akım Sitometri Tekniği ile Saptanması
Summary
Mevcut protokol, Japon ensefalit virüsü (JEV) aşılı çocuklarda periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC’ler) polifonksiyonel T hücresi (TPF) profillerini analiz etmek için ex vivo stimülasyon ve akış sitometrisini birleştirmektedir. JEV’e özgü TPF’lerin tespit yöntemi ve akış sitometrisi renk şeması, benzer çalışmalar için bir referans sağlamak üzere test edilmiştir.
Abstract
T hücresi aracılı bağışıklık, aşılamadan sonra veya doğal enfeksiyondan sonra flavivirüs enfeksiyonunun kontrolünde önemli bir rol oynar. Bir T hücresinin “kalitesinin” fonksiyona göre değerlendirilmesi gerekir ve daha yüksek fonksiyon daha güçlü bağışıklık koruması ile ilişkilidir. Tek hücre düzeyinde aynı anda iki veya daha fazla sitokin veya kemokin üretebilen T hücrelerine, degranülasyon belirteçlerini (CD107a) eksprese etmek ve interferon (IFN)-γ, tümör nekroz faktörü (TNF)-α, interlökin (IL)-2 veya makrofaj inflamatuar protein (MIP)-1α salgılamak için çeşitli moleküler mekanizmalar yoluyla bağışıklık tepkilerine aracılık eden polifonksiyonel T hücreleri (TPFs) denir. TPF’lerinuzun süreli immün hafızanın korunması ve korunması ile yakından ilişkili olduğuna ve artan oranlarının koruyucu bağışıklığın önemli bir belirteci olduğuna ve viral enfeksiyon ve reaktivasyonun etkin kontrolünde önemli olduğuna dair kanıtlar artmaktadır. Bu değerlendirme sadece spesifik immün yanıtlar için değil, aynı zamanda çapraz reaktif immün yanıtların değerlendirilmesi için de geçerlidir. Burada, Japon ensefalit virüsü (JEV) örnek alınarak, Japon ensefalitine karşı aşılanmış çocukların periferik kan mononükleer hücreleri tarafından üretilen JEV’e özgü TPF’lerintespit yöntemi ve akış sitometrisi renk şeması, benzer çalışmalar için bir referans sağlamak üzere test edilmiştir.
Introduction
Japon ensefalit virüsü (JEV), Flaviviridae familyası1 içindeki Flavivirus cinsine ait önemli bir sivrisinek kaynaklı virüstür. Birçok Asya-Pasifik ülkesi, Japon ensefalitinin (JE) neden olduğu büyük hastalık yükü nedeniyle uzun zamandır muazzam halk sağlığı zorluklarıyla karşı karşıya kalmıştır, ancak bu, çeşitli aşı türlerinin artan kullanılabilirliği ile çarpıcı bir şekilde iyileşmiştir2. Doğal enfeksiyon veya aşılama ile uyarlanan adaptif koruyucu immün yanıtlar, önleme ve antiviral düzenlemeye katkıda bulunur. Humoral immünite ve hücre aracılı immünite, adaptif immünite olarak sınıflandırılır ve birincisinin indüksiyonu, son3’te nispeten sınırlı bir anlayışla da olsa, aşı tasarımında her zaman kilit bir strateji olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, flavivirüs yayılımını ve virüs klerensini sınırlamada T hücresi aracılı bağışıklığın rolü giderek daha fazla odaklanmış ve kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır4. Ayrıca, T hücresi bağışıklığı sadece JEV’e özgü antiviral yanıtlarda vazgeçilmez olmakla kalmaz, aynı zamanda önceki çalışmalarda gösterildiği gibi heterolog flavivirüslerle sekonder enfeksiyondan çapraz korunmada da önemli bir rol oynar5. Bu etkinin enfeksiyon5’teki potansiyel antikor aracılı geliştirme etkilerini atlayabileceği düşünülmektedir. Not olarak, bu tür çapraz reaktif T hücresi bağışıklığı, özellikle flavivirüslere karşı aşıların ve antiviral ilaçların yokluğunda önemlidir. JEV enfeksiyonunda T hücrelerinin CD4+ ve CD8+ T hücreleri 6,7’ye göre katkısını belirlemek için birçok çalışma yapılmış olmasına rağmen, sitokinleri salgılayan ilgili soylar ve fonksiyonel çeşitliliği belirsizliğini korumaktadır, bu da yardımcı ve öldürücü T hücrelerinin kesin fonksiyonlarının aydınlatılmasının engellendiği anlamına gelmektedir.
Antiviral savunmalarının ölçeği, T hücresi yanıtlarının kalitesini belirler. Sitokin sekresyonu ve degranülasyon dahil olmak üzere iki veya daha fazla fonksiyonu uyumlu bir şekilde verebilen CD4 + veya CD8 + T hücreleri, tek hücreli seviye8’de spesifik stimülasyon üzerine çok fonksiyonlu T hücreleri (TPFs) olarak karakterize edilir. Tek veya çoklu sitokinler üreten CD4 + T hücrelerinin çeşitli etkileri ve bağışıklık hafızaları olabilir. Örneğin, IL-2 + IFN-γ + CD4 + T hücrelerinin, aşılama etkisinin değerlendirilmesinde önemli bir parametre olarak kullanılabilecek IL-2 + CD4 + T hücreleri9’dan uzun süreli etkili bir koruyucu yanıt oluşturma olasılığı daha yüksektir. Edinilmiş immün yetmezlik sendromunun (AIDS) uzun süreli ilerlememesi olan hastalarda IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T hücrelerinin sıklığı artarken, AIDS progresyonu olan hastalarda CD4+ T hücreleri, IL-2’nin T hücre proliferasyonu üzerindeki destekleyici etkisi nedeniyle tek başına IFN-γ üretmeye daha yatkındır10. Ayrıca, IL-2 + IFN-γ + TNF-α + ‘nın bir alt kümesinin in vivo olarak uzun süre hayatta kaldığı ve öldürme fonksiyonunu sinerjik olarak teşvik ettiği gösterilmiştir11. CD8 + T hücrelerinin sitotoksik aktivite gösterme olasılığı daha yüksek olmasına rağmen, bazı CD4 + T hücreleri, yüzey CD107a moleküllerinin12 dolaylı olarak tespit edilen bir ekspresyonu olarak sitotoksik aktivite ile donatılmıştır. Ek olarak, bazı T hücresi alt kümeleri, T hücresi aracılı nötrofil işe alımına katılmak için genellikle monositler tarafından salgılanan kemokin MIP-1α’yı eksprese eder13. Benzer şekilde, CD8 + TPFs, yukarıdaki belirteçlerin çok yönlülüğünü karakterize etmek için de kullanılabilir. Çalışmalar, prime-boost stratejisinin, aşılama ile ortaya çıkan korumayı artırabilecek uzun bir TPF koruyucu etkisüresi 13’ü etkili bir şekilde indükleyebileceğini göstermiştir. Bağışıklık sistemini incelemede merkezi bir özellik, hafıza T hücrelerinin naif T hücrelerinden daha ikincil viral zorluklara daha güçlü, daha hızlı ve daha etkili tepkiler verme yeteneğidir. Efektör bellek T hücreleri (TEM) ve merkezi bellek T hücreleri (TCM), genellikle CD27 / CD45RO veya CCR7 / CD45RA14’ün bileşik ekspresyonu ile farklılaşan önemli T hücresi alt kümeleridir. TCM (CD27+ CD45RO+ veya CCR7+ CD45RA-) sekonder lenfoid dokularda lokalize olma eğilimindeyken, TEM (CD27- CD45RO+ veya CCR7- CD45RA–) lenfoid ve periferik dokularda lokalize olur15,16. TEM acil fakat sürekli olmayan bir savunma sağlarken, TCM sekonder lenfoid organlarda çoğalarak ve yeni efektörler üreterek yanıtı sürdürür17. Bu nedenle, hafıza hücrelerinin virüslere karşı spesifik ve verimli hatırlama yanıtlarına aracılık edebileceği göz önüne alındığında, bu polifonksiyon alt kümesinin katkısı hakkında sorular ortaya çıkmaktadır.
Akış sitometrisi teknolojisinin gelişmesiyle birlikte, 10’dan fazla kümenin, fenotipin ve farklılaşma antijeninin belirteçlerini aynı anda tespit etmek yaygın hale gelmiştir; bu, yanlış yorumlamayı ve T hücresi fenotiplerinin anlaşılmasındaki zorlukları azaltmak için bireysel T hücreleri üzerindeki fonksiyonel immünolojik özellikleri daha bol bir şekilde açıklamak için faydalıdır. Bu çalışmada, JEV aşılı çocuklarda periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC’ler) TPF profillerini analiz etmek için ex vivo stimülasyon ve akış sitometrisi kullanılmıştır. Bu yaklaşım uygulanarak, aşılama ile indüklenen kısa ve uzun vadeli JEV’e özgü ve hatta çapraz reaktif T hücre bağışıklığının anlaşılması genişletilecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, JEV aşısı SA14-14-2 ile aşılanan çocukların PBMC’lerinde TPF profilleri için uygulanabilir bir akış sitometrisi tabanlı tespit yöntemini temsil eder. Bu çalışmada hem aşılanmış hem de aşılanmamış çocukların venöz kan PBMC’leri araştırma materyali olarak kullanılmıştır. PBMC’lerin JEV antijeni ile uyarılmasıyla, bu güçlendirilmiş antijene özgü TPFs, çok renkli akış sitometrisi antikor boyaması ile karakterize edilebilir. Geleneksel enzime bağl?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.W., Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82002130), Çin Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7222059) tarafından desteklenmiştir. ZD.X., CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-026) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
Referências
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery – A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A. Tissue-resident memory T cells. Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
