Summary

Klinisch microfluïdisch chipplatform voor de isolatie van veelzijdige circulerende tumorcellen

Published: October 13, 2023
doi:

Summary

De klinische microfluïdische chip is een belangrijke biomedische analysetechniek die de voorbewerking van bloedmonsters van klinische patiënten vereenvoudigt en immunofluorescentiekleurig circulerende tumorcellen (CTC’s) in situ op de chip kleurt, waardoor een snelle detectie en identificatie van een enkele CTC mogelijk is.

Abstract

Circulerende tumorcellen (CTC’s) zijn belangrijk in de prognose, diagnose en antikankertherapie. CTC-inventarisatie is van vitaal belang bij het bepalen van de ziekte van de patiënt, omdat CTC’s zeldzaam en heterogeen zijn. CTC’s worden losgemaakt van de primaire tumor, komen in het bloedcirculatiesysteem en groeien mogelijk op verre plaatsen, waardoor de tumor wordt uitgezaaid. Aangezien CTC’s vergelijkbare informatie bevatten als de primaire tumor, kunnen CTC-isolatie en daaropvolgende karakterisering van cruciaal belang zijn bij het monitoren en diagnosticeren van kanker. De opsomming, affiniteitsmodificatie en klinische immunofluorescentiekleuring van zeldzame CTC’s zijn krachtige methoden voor CTC-isolatie omdat ze de noodzakelijke elementen met een hoge gevoeligheid bieden. Microfluïdische chips bieden een vloeibare biopsiemethode die vrij is van pijn voor de patiënten. In dit werk presenteren we een lijst met protocollen voor klinische microfluïdische chips, een veelzijdig CTC-isolatieplatform, dat een reeks functionaliteiten en diensten bevat die nodig zijn voor CTC-scheiding, analyse en vroege diagnose, waardoor biomoleculaire analyse en kankerbehandeling worden vergemakkelijkt. Het programma omvat het tellen van zeldzame tumorcellen, klinische bloedvoorbewerking van patiënten, waaronder rode bloedcellyse, en de isolatie en herkenning van CTC’s in situ op microfluïdische chips. Het programma maakt de precieze inventarisatie van tumorcellen of CTC’s mogelijk. Daarnaast bevat het programma een tool die CTC-isolatie bevat met veelzijdige microfluïdische chips en immunofluorescentie-identificatie in situ op de chips, gevolgd door biomoleculaire analyse.

Introduction

Circulerende tumorcellen (CTC’s) zijn belangrijk in de prognose, diagnose en antikankertherapie. CTC-inventarisatie is van vitaal belang omdat CTC’s zeldzaam en heterogeen zijn. De opsomming, affiniteitsmodificatie en klinische immunofluorescentiekleuring van zeldzame CTC’s zijn krachtige technieken voor CTC-isolatie omdat ze de nodige elementen met een hoge gevoeligheid bieden1. Zeldzaam aantal tumorcellen gemengd met normaal bloed bootst echt patiëntenbloed nauw na, omdat 2-3 ml echt patiëntenbloed slechts 1-10 CTC’s bevat. Om een kritisch experimenteel probleem op te lossen, in plaats van een groot aantal tumorcellen te gebruiken die in PBS zijn geïntroduceerd of gemengd met normaal bloed, biedt het gebruik van een zeldzaam aantal tumorcellen ons een laag aantal bloedcellen, wat dichter bij de realiteit ligt bij het uitvoeren van een experiment.

Kanker is de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld2. CTC’s zijn tumorcellen die worden afgestoten van de oorspronkelijke tumor en die circuleren in het bloed en lymfecirculatiesystemen3. Wanneer CTC’s naar een nieuwe overlevingsomgeving verhuizen, groeien ze als een tweede tumor. Dit wordt metastase genoemd en is verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen bij kankerpatiënten4. CTC’s zijn van vitaal belang voor de prognose, vroege diagnose en voor het begrijpen van de mechanismen van kanker. CTC’s zijn echter uiterst zeldzaam en heterogeen in het bloed van de patiënt 5,6.

Microfluïdische chips bieden een vloeibare biopsie die de tumor niet binnendringt. Ze hebben het voordeel dat ze draagbaar zijn, goedkoop zijn en een op cellen afgestemde schaal hebben. De isolatie van CTC’s met microfluïdische chips wordt voornamelijk ingedeeld in twee soorten: affiniteitsgebaseerd, dat afhankelijk is van antigeen-antilichaambinding 7,8,9 en de oorspronkelijke en meest gebruikte methode van CTC-isolatie is; en fysieke chips, die gebruik maken van grootte- en vervormbaarheidsverschillen tussen tumorcellen en bloedcellen 10,11,12,13,14,15, zijn labelvrij en eenvoudig te bedienen. Het voordeel van microfluïdische chips ten opzichte van alternatieve technieken is dat de fysische benadering van big-ellips microfilters CTC’s stevig vangt met een hoge opname-efficiëntie. De reden hiervoor is dat ellipsmicroposten zijn georganiseerd in slanke tunnels van lijnspleten. De lijnspleten verschillen van de traditionele puntpuntspleten gevormd door microposten zoals ruitmicroposten. Wave-chip-gebaseerde opname van CTC’s combineert zowel fysieke eigenschapsgebaseerde als affiniteitsgebaseerde isolatie. Golfchip-gebaseerde opname omvat 30 golfvormige arrays met het antilichaam van anti-EpCAM gecoat op cirkelvormige microposts. De CTC’s worden opgevangen door de kleine openingen en de grote openingen worden gebruikt om het debiet te versnellen. De gemiste CTC’s moeten de kleine openingen in de volgende array passeren en worden opgevangen door de op affiniteit gebaseerde isolatie die in de chip16 is geïntegreerd.

Het doel van het protocol is om het tellen van zeldzame aantallen tumorcellen en de klinische analyse van CTC’s met microfluïdische chips aan te tonen. Het protocol beschrijft de CTC-isolatiestappen, hoe een laag aantal tumorcellen te verkrijgen, de klinische fysieke scheiding van kleine ellipsfilters, grote-ellipsfilters en trapeziumfilters, affiniteitsmodificatie en verrijking17.

Protocol

Bloedmonsters van patiënten werden geleverd door Longhua Hospital Affiliated to Shanghai Medical University.The protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van het Peking University Third Hospital. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten voor het gebruik van de monsters voor onderzoeksdoeleinden. 1. Pre-experiment om de vangstefficiëntie met gekweekte tumorcellen te controleren Kweek de tumorcellen MCF-7, MDA…

Representative Results

De hele installatie omvat een spuitpomp, een spuit en een microfluïdische chip. De celsuspensie in de spuit is verbonden met de spuitpomp en de celsuspensie wordt in de microfluïdische chip gebracht om de cellen op te vangen. De opname-efficiëntie voor alle gebruikte microfluïdische chips was ongeveer 90% of hoger. Voor de golfchip ontwierpen we microstructuren met gevarieerde openingen. De kleine openingen worden gebruikt om de CTC’s op te vangen en de grote openingen worden gebruikt om de stroomsnelheid te versnell…

Discussion

De prognose en vroege diagnose van kanker hebben een significant effect op de behandeling van kanker1. CTC-isolatie met microfluïdische chips biedt een vloeibare biopsie zonder invasie. CTC’s zijn echter uiterst zeldzaam en heterogeen in het bloed1, wat het een uitdaging maakt om CTC’s te isoleren. CTC’s hebben vergelijkbare eigenschappen als de oorspronkelijke tumorbronnen waaruit ze afkomstig zijn. CTC’s spelen dus een vitale rol bij kankermetastase1</s…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoekswerk werd ondersteund door de Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), de National Natural Science Foundation of China (21904003), het Scientific Research Project van Tianjin Education Commission (2018KJ154), het Provincial Natural Science Research Program of Higher Education Institutions of Anhui Province (KJ2020A0239) en het Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Verwerking, East China Normal University (MIP20221).

Materials

Calcein AM BIOTIUM 80011
calibrated microcapillary pipettes Sigma- Aldrich P0799
CD45-PE BD Biosciences 560975
CK-FITC BD Biosciences 347653 cytokeratin monoclonal antibody
DMEM HyClone SH30081.05
fetal bovine serum (FBS) GIBCO,USA 26140
Hoechst 33342 Molecular Probes, Solarbio Corp., China C0031
penicillin-streptomycin Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL) Solarbio, Beijing R1010

Referências

  1. Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
  2. . World Health Organization Cancer report Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022)
  3. Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
  4. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  5. Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
  6. Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
  7. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
  8. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  9. Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
  10. Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
  11. Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
  12. Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
  13. Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
  14. Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
  15. Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
  16. Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -. S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
  17. Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
  18. Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
check_url/pt/64674?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Chen, H., Han, Y., Li, Q., Zou, Y., Wang, S., Jiao, X. Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells. J. Vis. Exp. (200), e64674, doi:10.3791/64674 (2023).

View Video