Клиническая микрофлюидная чип-платформа для выделения универсальных циркулирующих опухолевых клеток
Summary
Клинический микрофлюидный чип является важным методом биомедицинского анализа, который упрощает предварительную обработку образцов крови клинического пациента и иммунофлуоресцентно окрашивает циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) in situ на чипе, что позволяет быстро обнаруживать и идентифицировать один ЦОК.
Abstract
Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) играют важную роль в прогнозе рака, диагностике и противораковой терапии. Перепись ЦОК имеет жизненно важное значение для определения заболевания пациента, поскольку ЦОК редки и неоднородны. ЦОК отделяются от первичной опухоли, попадают в систему кровообращения и потенциально растут в отдаленных местах, тем самым метастазируя опухоль. Поскольку ЦОК несут информацию, аналогичную первичной опухоли, выделение ЦОК и последующая характеристика могут иметь решающее значение для мониторинга и диагностики рака. Перечисление, аффинная модификация и клиническое иммунофлуоресцентное окрашивание редких ЦОК являются мощными методами выделения ЦОК, поскольку они обеспечивают необходимые элементы с высокой чувствительностью. Микрофлюидные чипы предлагают метод жидкой биопсии, который не вызывает боли у пациентов. В этой работе мы представляем список протоколов для клинических микрофлюидных чипов, универсальной платформы для выделения ЦОК, которые включают в себя набор функций и сервисов, необходимых для разделения, анализа и ранней диагностики ЦОК, тем самым облегчая биомолекулярный анализ и лечение рака. Программа включает в себя подсчет редких опухолевых клеток, предварительную обработку крови клинического пациента, которая включает лизис эритроцитов, а также выделение и распознавание ЦОК in situ на микрофлюидных чипах. Программа позволяет точно подсчитывать опухолевые клетки или CTCs. Кроме того, программа включает в себя инструмент, который включает в себя выделение CTC с помощью универсальных микрофлюидных чипов и иммунофлуоресцентную идентификацию in situ на чипах с последующим биомолекулярным анализом.
Introduction
Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) играют важную роль в прогнозе рака, диагностике и противораковой терапии. Перечисление CTC имеет жизненно важное значение, поскольку CTC редки и неоднородны. Перечисление, аффинная модификация и клиническое иммунофлуоресцентное окрашивание редких ЦОК являются мощными методами выделения ЦОК, поскольку они содержат необходимые элементы с высокойчувствительностью1. Редкое количество опухолевых клеток, смешанных с нормальной кровью, очень близко имитирует настоящую кровь пациента, так как 2-3 мл настоящей крови пациента содержат только 1-10 ЦОК. Для решения критической экспериментальной задачи вместо использования большого количества опухолевых клеток, введенных в PBS или смешанных с нормальной кровью, использование редкого количества опухолевых клеток обеспечивает нам низкое количество клеток крови, что ближе к реальности при проведении эксперимента.
Рак является основной причиной смерти в мире2. ЦОК представляют собой опухолевые клетки, выделяющиеся из исходной опухоли, которые циркулируют в системах кровообращения и лимфатического кровообращения3. Когда ЦОК перемещаются в новую среду обитания, они растут как вторая опухоль. Это называется метастазированием и является причиной 90% смертей у онкологических больных4. ЦОК жизненно важны для прогнозирования, ранней диагностики и понимания механизмов развития рака. Однако ЦОК крайне редки и неоднородны в крови пациента 5,6.
Микрофлюидные чипы обеспечивают жидкостную биопсию, которая не проникает в опухоль. Их преимущество заключается в том, что они портативны, недороги и имеют масштабы, соответствующие ячейкам. Выделение ЦОК с микрофлюидными чипами классифицируется в основном на два типа: аффинные, основанные на связывании антиген-антитела 7,8,9 и являющиеся оригинальным и наиболее широко используемым методом выделения ЦОК; и физические чипы, которые используют различия в размерах и деформируемости между опухолевыми клетками и клетками крови 10, 11, 12, 13, 14, 15, не имеют меток и просты в эксплуатации. Преимущество микрофлюидных чипов перед альтернативными методами заключается в том, что физический подход к многоэллипсным микрофильтрам надежно улавливает CTC с высокой эффективностью улавливания. Причина этого заключается в том, что эллипсовые микростолбы организованы в узкие туннели разрывов между линиями. Межлинейные зазоры отличаются от традиционных точечных зазоров, образованных микростолбами, такими как ромбовые микростолбы. Захват CTC на основе волнового чипа сочетает в себе изоляцию на основе физических свойств и изоляцию на основе сходства. Захват на основе волнового чипа включает в себя 30 волнообразных матриц с антителом анти-EpCAM, покрытым круглыми микроштифтами. CTC улавливаются маленькими зазорами, а большие зазоры используются для ускорения скорости потока. Пропущенные CTC должны пройти через небольшие зазоры в следующем массиве и захватываются изоляцией на основе сходства, интегрированной в микросхему16.
Целью протокола является демонстрация подсчета редкого количества опухолевых клеток и клинического анализа ЦОК с помощью микрофлюидных чипов. Протокол описывает этапы выделения ЦОК, способы получения низкого количества опухолевых клеток, клиническое физическое разделение фильтров с малым эллипсом, фильтров с большим эллипсом и трапециевидных фильтров, модификацию сродства и обогащение17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Прогноз и ранняя диагностика рака оказывают существенное влияние на лечение рака1. Изоляция ЦОК с помощью микрофлюидных чипов обеспечивает жидкостную биопсию без инвазии. Однако ЦОК крайне редки и неоднородныв крови1, что затрудняет выделение ЦОК. ЦОК обладаю…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта исследовательская работа была поддержана Аньхойским фондом естественных наук Китая (1908085MF197, 1908085QB66), Национальным фондом естественных наук Китая (21904003), Научно-исследовательским проектом Тяньцзиньской комиссии по образованию (2018KJ154), Провинциальной программой естественнонаучных исследований высших учебных заведений провинции Аньхой (KJ2020A0239) и Шанхайской ключевой лабораторией многомерной обработки информации, Восточно-китайской ключевой лабораторией многомерной информации Обработка, Восточно-Китайский педагогический университет (MIP20221).
Materials
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
Referências
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- . World Health Organization Cancer report Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022)
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -. S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
