ज़ेबराफिश टोल 2 सिस्टम: एक मॉड्यूलर और फ्लेक्सिबल गेटवे-आधारित ट्रांसजेनेसिस दृष्टिकोण
Summary
यह काम मॉड्यूलर टोल 2 ट्रांसजेनेसिस सिस्टम के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो जेब्राफिश भ्रूण में ट्रांसजेनिक संरचनाओं को बनाने और इंजेक्ट करने के लिए एक गेटवे-आधारित क्लोनिंग विधि है।
Abstract
भ्रूण अल्कोहल स्पेक्ट्रम विकार (एफएएसडी) संरचनात्मक दोषों और संज्ञानात्मक हानि के एक अत्यधिक परिवर्तनशील सेट की विशेषता है जो प्रसवपूर्व इथेनॉल जोखिम के कारण उत्पन्न होते हैं। एफएएसडी की जटिल विकृति के कारण, पशु मॉडल इथेनॉल-प्रेरित विकास दोषों की हमारी वर्तमान समझ के लिए महत्वपूर्ण साबित हुए हैं। जेब्राफिश और मनुष्यों के बीच आनुवंशिकी और विकास दोनों के संरक्षण के उच्च स्तर के कारण इथेनॉल-प्रेरित विकास दोषों की जांच करने के लिए ज़ेबराफ़िश एक शक्तिशाली मॉडल साबित हुआ है। एक मॉडल प्रणाली के रूप में, ज़ेबराफिश में कई विशेषताएं होती हैं जो उन्हें विकास ता्मक अध्ययनों के लिए आदर्श बनाती हैं, जिसमें बड़ी संख्या में बाहरी निषेचित भ्रूण शामिल हैं जो आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य और पारभासी हैं। यह शोधकर्ताओं को कई आनुवंशिक संदर्भों में इथेनॉल एक्सपोजर के समय और खुराक को ठीक से नियंत्रित करने की अनुमति देता है। ज़ेबराफ़िश में उपलब्ध एक महत्वपूर्ण आनुवंशिक उपकरण ट्रांसजेनेसिस है। हालांकि, ट्रांसजेनिक संरचनाओं को उत्पन्न करना और ट्रांसजेनिक लाइनों की स्थापना जटिल और कठिन हो सकती है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, ज़ेब्राफिश शोधकर्ताओं ने ट्रांसपोसन-आधारित टोल 2 ट्रांसजेनेसिस सिस्टम की स्थापना की है। यह मॉड्यूलर सिस्टम पूर्ण टोल 2 ट्रांसपोसन-आधारित ट्रांसजेनिक संरचनाओं की त्वरित असेंबली के लिए एक मल्टीसाइट गेटवे क्लोनिंग दृष्टिकोण का उपयोग करता है। यहां, हम लचीले टोल 2 सिस्टम टूलबॉक्स और जेब्राफिश ट्रांसजेनेसिस और इथेनॉल अध्ययन में उनके उपयोग के लिए तैयार ट्रांसजेनिक संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Introduction
प्रसवपूर्व इथेनॉल एक्सपोजर संरचनात्मक घाटे और संज्ञानात्मक हानि की निरंतरता को जन्म देता है जिसे भ्रूण अल्कोहल स्पेक्ट्रम विकार (एफएएसडी) 1,2,3,4 कहा जाता है। कई कारकों के बीच जटिल संबंध मनुष्यों में एफएएसडी के एटियलजि का अध्ययन और समझना चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। इस चुनौती को हल करने के लिए, विभिन्न प्रकार के पशु मॉडल का उपयोग किया गया है। इन मॉडलों में उपलब्ध जैविक और प्रयोगात्मक उपकरण इथेनॉल टेराटोजेनिकता के यांत्रिक आधार की हमारी समझ को विकसित करने में महत्वपूर्ण साबित हुए हैं, और इन मॉडल प्रणालियों के परिणाम उल्लेखनीय रूप से मानव इथेनॉल अध्ययन 5,6 में पाए जाने वाले के अनुरूप हैं। इनमें से, ज़ेब्राफिश इथेनॉल टेराटोजेनेसिस 7,8 का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में उभरा है, जो उनके बाहरी निषेचन, उच्च उर्वरता, आनुवंशिक पथगम्यता और पारभासी भ्रूण के कारण है। ये ताकत ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों का उपयोग करके एफएएसडी के वास्तविक समय लाइव इमेजिंग अध्ययन के लिए जेब्राफिश को आदर्श बनाने के लिए गठबंधन करती है।
ट्रांसजेनिक ज़ेबराफिश का बड़े पैमाने पर भ्रूण के विकास के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गयाहै। हालांकि, ट्रांसजेनिक संरचनाओं और बाद में ट्रांसजेनिक लाइनों का निर्माण करना अत्यधिक कठिन हो सकता है। एक मानक ट्रांसजीन को ट्रांसजीन और पॉली ए सिग्नल या “पूंछ” को चलाने के लिए एक सक्रिय प्रमोटर तत्व की आवश्यकता होती है, सभी सामान्य वेक्टर रखरखाव के लिए एक स्थिर जीवाणु वेक्टर में। बहु-घटक ट्रांसजेनिक निर्माण की पारंपरिक पीढ़ी को कई समय लेने वाले उप-क्लोनिंग चरण10 की आवश्यकता होती है। पीसीआर-आधारित दृष्टिकोण, जैसे गिब्सन असेंबली, उप-क्लोनिंग से जुड़े कुछ मुद्दों को दरकिनार कर सकते हैं। हालांकि, प्रत्येक अद्वितीय ट्रांसजेनिक निर्माण10 की पीढ़ी के लिए अद्वितीय प्राइमरों को डिजाइन और परीक्षण किया जाना चाहिए। ट्रांसजीन निर्माण से परे, जीनोमिक एकीकरण, जर्मलाइन ट्रांसमिशन, और उचित ट्रांसजीन एकीकरण के लिए स्क्रीनिंग भी मुश्किल रही है। यहां, हम ट्रांसपोसन-आधारित टोल 2 ट्रांसजेनेसिस सिस्टम (Tol2Kit) 10,11 का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह मॉड्यूलर सिस्टम मल्टीसाइट गेटवे क्लोनिंग का उपयोग करता है ताकि “एंट्री” और “गंतव्य” वैक्टर के लगातार विस्तारित पुस्तकालय से कई ट्रांसजेनिक संरचनाओं को जल्दी से उत्पन्न किया जा सके। एकीकृत टोल 2 ट्रांसपोसेबल तत्व ट्रांसजेनेसिस की दर को बहुत बढ़ाते हैं, जिससे कई ट्रांसजेन के तेजी से निर्माण और जीनोमिक एकीकरण की अनुमति मिलती है। इस प्रणाली का उपयोग करके, हम दिखाते हैं कि एफएएसडी अंतर्निहित ऊतक-विशिष्ट संरचनात्मक दोषों का अध्ययन करने के लिए एंडोडर्म ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइन की पीढ़ी का उपयोग कैसे किया जा सकता है। अंततः, इस प्रोटोकॉल में, हम दिखाते हैं कि मॉड्यूलर सेटअप और ट्रांसजेनिक संरचनाओं का निर्माण ज़ेब्राफिश-आधारित एफएएसडी अनुसंधान में बहुत सहायता करेगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
जेब्राफिश विकास औररोग राज्यों पर इथेनॉल जोखिम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल हैं। ज़ेबराफिश बड़ी संख्या में पारभासी, बाहरी रूप से निषेचित, आनुवंशिक रूप से व?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस लेख में प्रस्तुत शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ / नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन अल्कोहल एब्यूज (एनआईएच / एनआईएएए) आर 00एए 023560 से सीबीएल को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
Referências
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