Method Article

O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

DOI:

10.3791/64679

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho descreve um protocolo para o sistema modular de transgênese Tol2, um método de clonagem baseado em gateway para criar e injetar construções transgênicas em embriões de peixe-zebra.

Abstract

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Os transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF) são caracterizados por um conjunto altamente variável de defeitos estruturais e prejuízos cognitivos que surgem devido à exposição pré-natal ao etanol. Devido à complexa patologia do TEAF, modelos animais têm se mostrado críticos para nossa compreensão atual dos defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol. O peixe-zebra provou ser um modelo poderoso para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol devido ao alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento entre peixes-zebra e humanos. Como um sistema modelo, o peixe-zebra possui muitos atributos que os tornam ideais para estudos de desenvolvimento, incluindo um grande número de embriões fertilizados externamente que são geneticamente tratáveis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem com precisão o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em vários contextos genéticos. Uma importante ferramenta genética disponível no peixe-zebra é a transgênese. No entanto, gerar construções transgênicas e estabelecer linhagens transgênicas pode ser complexo e difícil. Para resolver essa questão, os pesquisadores do peixe-zebra estabeleceram o sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon. Este sistema modular usa uma abordagem de clonagem de Gateway multisite para a montagem rápida de construções transgênicas completas baseadas em transposon Tol2. Aqui, descrevemos a caixa de ferramentas do sistema flexível Tol2 e um protocolo para geração de construções transgênicas prontas para a transgênese de peixe-zebra e seu uso em estudos de etanol.

Introduction

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A exposição pré-natal ao etanol dá origem a um continuum de déficits estruturais e comprometimentos cognitivos denominados transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF)1,2,3,4. As complexas relações entre múltiplos fatores tornam o estudo e a compreensão da etiologia do TEAF em humanos um desafio. Para resolver esse desafio, uma grande variedade de modelos animais tem sido utilizada. As ferramentas biológicas e experimentais disponíveis nesses modelos têm se mostrado cruciais no desenvolvimento de nossa compreensão das bases mecanicistas da....

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Protocol

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Todos os embriões de zebrafish utilizados neste procedimento foram criados e criados seguindo os protocolos estabelecidos pela IACUC12. Esses protocolos foram aprovados pela Universidade de Louisville.

NOTA: A linhagem de peixe-zebra selvagem, AB, e a linhagem dupla mutante bmp4st72;smad5b1100 foram usadas neste estudo. Toda a água utilizada neste procedimento foi água de osmose reversa estéril. As imagens confocais foram obtidas em microscópio confocal de varredura a laser. As medidas da endoderme foram realizadas utilizando-se a ferramenta de medida do ImageJ. Todas as análises estatí....

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Results

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Para gerar as construções transgênicas, foi utilizado o sistema de transgênese Tol2. Três vetores de entrada, incluindo p5E, que contém os elementos promotores/potencializadores do gene, pME, que mantém o gene a ser expresso pelos elementos promotores/intensificadores, e p3E, que, no mínimo, contém a cauda poliA, foram usados para gerar a construção transgênica via clonagem LR de gateway multissite. O vetor de destino, pDest, fornece as repetições de Tol2 para a inserção genômica da construção transgênica em emb.......

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Discussion

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Os peixes-zebra são ideais para estudar o impacto da exposição ao etanol no desenvolvimento e estados de doença 7,8. Os peixes-zebra produzem um grande número de embriões translúcidos, fertilizados externamente e geneticamente tratáveis, o que permite a obtenção de imagens vivas de vários tecidos e tipos celulares marcados com transgenes simultaneamente em múltiplos contextos ambientais19,20. Esses pontos.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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A pesquisa apresentada neste artigo foi apoiada por uma bolsa do National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 para C.B.L.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Caixa de ferramentas Addgene Tol2https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
ArFornecido diretamente pela universidade
AmpicilinaFisher ScientificBP1760
Balança AnalíticaVWR10204-962
Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID CapilarFHC30-30-0
Cloreto de cálcioVWR97062-590
CloranfenicolBioVision2486
EDTAFisher ScientificBP118-500
Microscópio de dissecação fluorescenteOlympusSZX16
KanamicinaFisher ScientificBP906
Microscópio confocal de varredura a laserOlympusFluoview FV1000
Lawson Lab Doador Plasmídeo Preparaçãohttps://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LBAgar Fisher ScientificBP9724
LB CaldoFisher ScientificBP1426
Baixo-EEO/Multiuso/Biologia Molecular Grau AgaroseFisher ScientificBP160-500
LR Enzima Clonase II PlusFisher Scientific12538200
Magnésio (Heptahidratado)Fisher ScientificM63-500
Micro Pipeta porta-PipetaInstrumentaçãoCientífica Aplicada MIMPH-M-PIP
Tubo de Microcentrífuga 0.5 mL VWR10025-724
Tubo de microcentrífuga 1.5 mL VWR10025-716
MicromanipuladorInstrumentação Científica AplicadaMM33
Pontas de micropipeta 10 μ L Fisher Scientific13611106
Pontas de Micropipeta 1000 μ L Fisher Scientific13611127
Pontas de Micropipeta 200 μ L Fisher Scientific13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6Planilha de Cálculo Fisher ScientificAM1340
Mosimann Lab Tol2https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
Espectrofotômetro NanoDropNanoDropND-1000
NcoINEBR0189S
NotINEBR0189S
Placas de Petri 100 mm Fisher ScientificFB012924
Sal de sódio vermelho de fenolSigma AldrichP4758-5G
Micropipeta Pipetman L p1000LGilsonFA10006M
Micropipeta Pipetman L p200L GilsonFA10005M
Micropipeta Pipetman L p2LGilsonFA10001M
Cloreto de potássioFisher ScientificP217-500
Fosfato de potássio (dibásico)VWRBDH9266-500G
Injetor de pressãoInstrumentação científica aplicadaMPPI-3
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Bicarbonato de sódioVWRBDH9280-500G
Cloreto de sódioFisher ScientificS271-500
Fosfato de Sódio (Dibásico)Fisher ScientificS374-500
Stericup .22 µ M Sistema de Filtração a Vácuo Página Wiki da MilliporeSCGPU11RE
Tol2http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Quimicamente Competentes E. coliFisher ScientificC404010
Extrator de Pipetter VerticalDavid Kopf Instruments720
Molde de microinjeção de peixe-zebraFerramentas de Ciência Adaptativai34
Sulfato de Kit de Transcrição

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.

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Tol2 TransgenesisZebrafish ModelGateway CloningTransgenic ZebrafishEmbryo InjectionFetal Alcohol SpectrumTransposase mRNAGermline TransmissionFluorescent MarkerEthanol Exposure

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