マルチウェルデバイスの固体培地上での単離 されたカエノラブディティスエレガンスの 長期培養とモニタリング
Summary
ここには、微細加工されたマルチウェルデバイスの固体培地上で単離された個々の線虫を培養するための最適化されたプロトコルが提示されます。このアプローチにより、個々の動物を生涯を通じて監視して、活動、体のサイズと形状、運動の形状、生存など、老化と健康に関連するさまざまな表現型を確認できます。
Abstract
線虫 Caenorhabditis elegansは 、そのシンプルで安価な培養技術、迅速な繁殖サイクル(~3日)、短い寿命(~3週間)、および遺伝子操作と分子分析のための多数の利用可能なツールにより、老化研究で使用される最も一般的なモデルシステムの1つです。生存分析を含む C.エレガンスの老化研究を実施するための最も一般的なアプローチは、ペトリプレートの固体線虫増殖培地(NGM)上で数十〜数百匹の動物の集団を一緒に培養することです。このアプローチは動物の集団に関するデータを収集しますが、ほとんどのプロトコルは個々の動物を経時的に追跡しません。ここでは、WorMotelsと呼ばれる微細加工ポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイスで個々の動物を長期間培養するための最適化されたプロトコルを紹介します。各装置では、NGMを含む小さなウェルで最大240匹の動物を培養でき、各ウェルは硫酸銅を含む堀で分離され、動物が逃げるのを防ぎます。このホワイト ペーパーでは、元の WorMotel の説明に基づいて、各デバイスの成形、準備、および装着に関する詳細なプロトコルを提供し、一般的な技術的問題の説明とトラブルシューティングのアドバイスを提供します。このプロトコルには、少量のNGMの一貫した負荷、NGMと細菌性食品の両方の一貫した乾燥、薬理学的介入を提供するためのオプション、PDMSデバイスの再利用に関する指示と実際的な制限、および低湿度環境でも乾燥を最小限に抑えるためのヒントがあります。この技術により、ペトリプレートの固体培地での集団培養の標準的な技術と同様の環境で、刺激された活動、刺激されていない活動、体のサイズ、運動形状、健康寿命、生存など、さまざまな生理学的パラメーターの縦断的モニタリングが可能になります。この方法は、自動顕微鏡および分析ソフトウェアと組み合わせて使用 すると、ハイスループットデータ収集と互換性があります。最後に、この技術の限界、およびマイクロトレイを使用して単離された線虫を固体培地上で培養する最近開発された方法とのこのアプローチの比較について説明します。
Introduction
Caenorhabditis elegans は、その短い世代時間(約3日)、短い寿命(約3週間)、実験室での培養の容易さ、哺乳類との分子プロセスと経路の高度な進化的保存、および遺伝子操作技術の幅広い利用可能性のために、老化研究で一般的に使用されます。老化研究の文脈では、 C.エレガンスは 、生きている動物の晩年の表現型の分析のために、長寿データと高齢者集団の迅速な生成を可能にします。ワーム老化研究を実施するための典型的なアプローチは、6cmペトリプレート内の固体寒天線虫増殖培地(NGM)上で20〜70匹の動物のグループで維持されているワームの集団の寿命を手動で測定することを含む1。年齢同期集団を使用すると、集団全体の個々の動物の寿命または断面表現型を測定できますが、この方法では、個々の動物の特性を経時的に監視することはできません。このアプローチも労働集約的であるため、テストできる母集団のサイズが制限されます。
個々のC.エレガンスの寿命を通して縦断的にモニタリングできる培養方法は限られており、それぞれに異なる長所と短所があります。WormFarm2、NemaLife3、および「挙動」チップ4、とりわけ5,6,7を含むマイクロ流体デバイスは、個々の動物の経時的なモニタリングを可能にする。マルチウェルプレートを使用して液体培養でワームを培養することも同様に、個々の動物またはC.エレガンスの小さな集団のいずれかを経時的にモニタリングすることを可能にします8,9。液体環境は、ペトリプレートの固体培地上の一般的な培養環境とは異なる環境状況を表しており、脂肪含有量やストレス応答遺伝子の発現など、老化に関連する動物生理学の側面を変える可能性があります10,11。これらの研究を、老化したC.エレガンスについて収集されたデータの大部分と直接比較する能力は、潜在的に重要な環境変数の違いによって制限されます。Worm Corral12は、典型的な固体培地培養をより厳密に再現する環境で個々の動物を収容するために開発された1つのアプローチです。Worm Corralには、ヒドロゲルを使用した顕微鏡スライド上に各動物用の密閉チャンバーが含まれており、孤立した動物の縦方向のモニタリングが可能です。この方法では、標準的な明視野イメージングを使用して、体のサイズや活動などの形態学的データを記録します。しかしながら、動物は胚としてヒドロゲル環境に置かれ、そこでそれらは生涯を通じて邪魔されないままである。これには、条件付き無菌変異体またはトランスジェニック遺伝的背景の使用が必要であり、各新規変異または導入遺伝子を条件付き不妊でバックグラウンドに交配する必要があるため、遺伝子スクリーニングの能力と、治療は胚として動物に一度しか適用できないため、薬物スクリーニングの能力の両方が制限されます。
Fang-Yenラボによって開発された代替方法は、WorMotel13,14と呼ばれる微細加工ポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイスの個々のウェル内の固体培地上でワームを培養することを可能にする。各デバイスは、単一ウェルトレイ(すなわち、96ウェルプレートと同じ寸法)に配置され、ワームがウェル間を移動するのを防ぐために、嫌悪溶液で満たされた堀によって分離された240ウェルを有する。各ウェルは、その寿命の間、単一のワームを収容することができます。デバイスは吸水性ポリアクリルアミドゲルペレット(「水結晶」と呼ばれる)に囲まれており、トレイは湿度を維持し、メディアの乾燥を最小限に抑えるためにParafilmラボフィルムで密封されています。このシステムにより、個々の動物の健康寿命と寿命のデータを収集できますが、固体培地を使用すると、公開されたC.エレガンスの寿命研究の大部分で動物が経験した環境をよりよく再現できるため、より直接的な比較が可能になります。最近、PDMSデバイス16の代わりに、微小細胞毒性アッセイ15に元々使用されていたポリスチレンマイクロトレイを使用して同様の技術が開発された。マイクロトレイ法は、固体培地上で培養されたワームの個別化されたデータの収集を可能にし、典型的には逃げを引き起こす条件(例えば、ストレッサーまたは食事制限)の下でワームを収容する能力が向上し、トレードオフは、各マイクロトレイが96匹の動物しか収容できないというトレードオフである16、ここで使用されるマルチウェル装置は最大240匹の動物を収容することができる。
ここでは、プレート間の一貫性と複数のデバイスの並列調製に最適化されたマルチウェルデバイスを調製するための詳細なプロトコルを示します。このプロトコルは、Fang-Yen研究所13の元のプロトコルから採用されました。具体的には、汚染を最小限に抑え、固体培地と細菌の食物源の両方の一貫した乾燥を最適化し、RNAiと薬物を送達する技術の説明があります。このシステムは、個人の健康寿命、寿命、および体のサイズや形状などの他の表現型を追跡するために使用できます。これらのマルチウェルデバイスは、寿命を測定するための既存のハイスループットシステムと互換性があり、従来の寿命実験に伴う手作業の多くを排除し、個々の C.エレガンス における自動化された直接的な寿命測定と健康追跡の機会を大規模に提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
WorMotelシステムは、何百もの孤立した C.エレガンスの 個別化されたデータを経時的に収集するための強力なツールです。発生停止、運動行動、および老化のアプリケーションにマルチウェルデバイスを使用した以前の研究に続いて、この作業の目標は、活動、健康、および寿命をより高いスループットの方法で長期間監視するためのマルチウェルデバイスの準備を最適化することでし?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH R35GM133588からG.L.S.、米国医学アカデミー触媒賞、アリゾナ州理事会が管理するアリゾナ州技術研究イニシアチブ基金、およびエリソン医学財団によってサポートされました。
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
Referências
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