Culture à long terme et surveillance de Caenorhabditis elegans isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits
Summary
Un protocole optimisé pour la culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits microfabriqués est présenté ici. Cette approche permet de surveiller chaque animal tout au long de sa vie pour une variété de phénotypes liés au vieillissement et à la santé, y compris l’activité, la taille et la forme du corps, la géométrie du mouvement et la survie.
Abstract
Le nématode Caenorhabditis elegans est l’un des systèmes modèles les plus couramment utilisés dans la recherche sur le vieillissement en raison de ses techniques de culture simples et peu coûteuses, de son cycle de reproduction rapide (~3 jours), de sa courte durée de vie (~3 semaines) et de ses nombreux outils disponibles pour la manipulation génétique et l’analyse moléculaire. L’approche la plus courante pour mener des études sur le vieillissement chez C. elegans, y compris l’analyse de survie, consiste à cultiver des populations de dizaines à des centaines d’animaux ensemble sur des milieux de croissance de nématodes solides (NGM) dans des plaques de Petri. Bien que cette approche recueille des données sur une population d’animaux, la plupart des protocoles ne suivent pas les animaux individuels au fil du temps. Un protocole optimisé pour la culture à long terme d’animaux individuels sur des dispositifs microfabriqués de polydiméthylsiloxane (PDMS) microfabriqués appelés WorMotels est présenté ici. Chaque dispositif permet de cultiver jusqu’à 240 animaux dans de petits puits contenant du NGM, chaque puits étant isolé par un fossé contenant du sulfate de cuivre qui empêche les animaux de fuir. S’appuyant sur la description originale de WorMotel, ce document fournit un protocole détaillé pour le moulage, la préparation et le remplissage de chaque appareil, avec des descriptions des complications techniques courantes et des conseils pour le dépannage. Ce protocole comprend des techniques pour le chargement constant de NGM en petit volume, le séchage constant du NGM et des aliments bactériens, des options pour la réalisation d’interventions pharmacologiques, des instructions et des limites pratiques pour la réutilisation des dispositifs PDMS, et des conseils pour minimiser la dessiccation, même dans des environnements à faible humidité. Cette technique permet la surveillance longitudinale de divers paramètres physiologiques, y compris l’activité stimulée, l’activité non stimulée, la taille corporelle, la géométrie du mouvement, la durée de santé et la survie, dans un environnement similaire à la technique standard pour la culture de groupe sur des milieux solides dans des plaques de Petri. Cette méthode est compatible avec la collecte de données à haut débit lorsqu’elle est utilisée conjointement avec un logiciel de microscopie et d’analyse automatisé. Enfin, les limites de cette technique sont discutées, ainsi qu’une comparaison de cette approche avec une méthode récemment développée qui utilise des microplateaux pour cultiver des nématodes isolés sur des milieux solides.
Introduction
Caenorhabditis elegans est couramment utilisé dans les études sur le vieillissement en raison de son temps de génération court (environ 3 jours), de sa courte durée de vie (environ 3 semaines), de sa facilité de culture en laboratoire, de son degré élevé de conservation évolutive des processus moléculaires et des voies avec les mammifères et de la grande disponibilité des techniques de manipulation génétique. Dans le contexte des études sur le vieillissement, C. elegans permet la génération rapide de données sur la longévité et de populations âgées pour l’analyse des phénotypes en fin de vie chez les animaux vivants. L’approche typique pour mener des études sur le vieillissement des vers consiste à mesurer manuellement la durée de vie d’une population de vers maintenue en groupes de 20 à 70 animaux sur milieu de croissance du nématode gélose solide (NGM) dans des plaques de Petri de 6 cm1. L’utilisation de populations synchronisées selon l’âge permet de mesurer la durée de vie ou les phénotypes transversaux chez les animaux individuels de la population, mais cette méthode empêche de surveiller les caractéristiques des animaux individuels au fil du temps. Cette approche est également exigeante en main-d’œuvre, limitant ainsi la taille de la population pouvant être testée.
Il existe un nombre limité de méthodes de culture qui permettent la surveillance longitudinale de C. elegans tout au long de leur vie, et chacune présente un ensemble distinct d’avantages et d’inconvénients. Les dispositifs microfluidiques, y compris WormFarm2, NemaLife3 et la puce « comportementale »4, entre autres 5,6,7, permettent de surveiller des animaux individuels au fil du temps. La culture de vers en culture liquide à l’aide de plaques multipuits permet également de surveiller des animaux individuels ou de petites populations de C. elegans au fil du temps 8,9. L’environnement liquide représente un contexte environnemental distinct de l’environnement de culture commun sur les milieux solides dans les plaques de Petri, ce qui peut modifier les aspects de la physiologie animale qui sont pertinents pour le vieillissement, y compris la teneur en graisse et l’expression des gènes de réponse au stress10,11. La capacité de comparer directement ces études à la majorité des données recueillies sur le vieillissement de C. elegans est limitée par les différences dans les variables environnementales potentiellement importantes. Le Worm Corral12 est une approche développée pour héberger des animaux individuels dans un environnement qui reproduit plus fidèlement la culture médiatique solide typique. Le Worm Corral contient une chambre scellée pour chaque animal sur une lame de microscope utilisant de l’hydrogel, permettant la surveillance longitudinale des animaux isolés. Cette méthode utilise l’imagerie en fond clair standard pour enregistrer des données morphologiques, telles que la taille et l’activité corporelles. Cependant, les animaux sont placés dans l’environnement hydrogel en tant qu’embryons, où ils restent intacts tout au long de leur vie. Cela nécessite l’utilisation de milieux génétiques mutants ou transgéniques conditionnellement stériles, ce qui limite à la fois la capacité de dépistage génétique, car chaque nouvelle mutation ou transgène doit être croisé dans un arrière-plan avec stérilité conditionnelle, et la capacité de dépistage de médicaments, car les traitements ne peuvent être appliqués qu’une seule fois aux animaux en tant qu’embryons.
Une méthode alternative développée par le laboratoire Fang-Yen permet la culture de vers sur des milieux solides dans des puits individuels d’un dispositif microfabriqué de polydiméthylsiloxane (PDMS) appelé WorMotel13,14. Chaque dispositif est placé dans un plateau à puits unique (c’est-à-dire avec les mêmes dimensions qu’une plaque de 96 puits) et comporte 240 puits séparés par un fossé rempli d’une solution aversive pour empêcher les vers de se déplacer entre les puits. Chaque puits peut abriter un seul ver pendant toute sa durée de vie. L’appareil est entouré de granulés de gel de polyacrylamide absorbant l’eau (appelés « cristaux d’eau »), et le plateau est scellé avec un film de laboratoire Parafilm pour maintenir l’humidité et minimiser la dessiccation du média. Ce système permet de recueillir des données sur la durée de vie et la durée de vie de chaque animal, tandis que l’utilisation de milieux solides récapitule mieux l’environnement vécu par les animaux dans la grande majorité des études publiées sur la durée de vie de C. elegans, permettant ainsi des comparaisons plus directes. Récemment, une technique similaire a été développée en utilisant des microplateaux en polystyrène qui étaient à l’origine utilisés pour les tests de microcytotoxicité15 à la place du dispositif PDMS16. La méthode des microplateaux permet de recueillir des données individualisées sur les vers cultivés sur des milieux solides et a amélioré la capacité de contenir les vers dans des conditions qui causeraient généralement la fuite (par exemple, les facteurs de stress ou les restrictions alimentaires), le compromis étant que chaque microplateau ne peut contenir que 96 animaux16, alors que le dispositif multipuits utilisé ici peut contenir jusqu’à 240 animaux.
Vous trouverez ici un protocole détaillé pour la préparation de dispositifs multipuits optimisé pour la cohérence de plaque à plaque et la préparation de plusieurs dispositifs en parallèle. Ce protocole a été adapté du protocole original du laboratoire Fang-Yen13. Plus précisément, il existe des descriptions de techniques visant à minimiser la contamination, à optimiser le séchage constant des milieux solides et de la source alimentaire bactérienne, et à administrer l’ARNi et les médicaments. Ce système peut être utilisé pour suivre la durée de santé individuelle, la durée de vie et d’autres phénotypes, tels que la taille et la forme du corps. Ces dispositifs multipuits sont compatibles avec les systèmes à haut débit existants pour mesurer la durée de vie, ce qui peut éliminer une grande partie du travail manuel impliqué dans les expériences traditionnelles sur la durée de vie et offrir la possibilité de mesurer la longévité et de suivre la santé de C. elegans à grande échelle automatisés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système WorMotel est un outil puissant pour recueillir des données individualisées pour des centaines de C. elegans isolés au fil du temps. À la suite des études antérieures utilisant des dispositifs multipuits pour des applications dans la quiescence développementale, le comportement locomoteur et le vieillissement, l’objectif de ce travail était d’optimiser la préparation de dispositifs multipuits pour la surveillance à long terme de l’activité, de la santé et de la durée de vie de mani?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIH R35GM133588 à G.L.S., un prix Catalyst de l’Académie nationale de médecine des États-Unis à G.L.S., le Fonds d’initiative de technologie et de recherche de l’État de l’Arizona administré par l’Arizona Board of Regents et la Fondation médicale Ellison.
Materials
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
Referências
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