Langetermijnkweek van individuele Caenorhabditis elegans op vaste media voor longitudinale fluorescentiemonitoring en aversieve interventies

Summary

Hier presenteren we een protocol om geïsoleerde individuele nematoden op vaste media te kweken voor levenslange fysiologische parametertracking en fluorescentiekwantificering. Dit kweeksysteem omvat een palmitinezuurbarrière rond putten met één worm om te voorkomen dat dieren vluchten, waardoor aversieve interventies mogelijk zijn, waaronder pathogene bacteriën en chemische stressoren.

Abstract

Caenorhabditis elegans worden veel gebruikt om verouderingsbiologie te bestuderen. De standaardpraktijk in C. elegans verouderingsstudies is het kweken van groepen wormen op vaste nematodengroeimedia (NGM), waardoor de efficiënte verzameling van gegevens op populatieniveau voor overleving en andere fysiologische fenotypen mogelijk is, en periodieke bemonstering van subpopulaties voor fluorescerende biomarkerkwantificering. Beperkingen van deze aanpak zijn het onvermogen om (1) individuele wormen in de loop van de tijd te volgen om leeftijdstrajecten te ontwikkelen voor fenotypes van belang en (2) fluorescerende biomarkers direct in de context van de kweekomgeving te monitoren. Alternatieve kweekbenaderingen gebruiken vloeibare cultuur of microfluïdica om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen, in sommige gevallen inclusief fluorescentiekwantificering, met de afweging dat de kweekomgeving contextueel verschilt van vaste NGM. De WorMotel is een eerder beschreven microfabricated multi-well apparaat voor het kweken van geïsoleerde wormen op vaste NGM. Elke worm wordt bewaard in een put met vaste NGM omgeven door een gracht gevuld met kopersulfaat, een contactafweermiddel voor C. elegans, waardoor longitudinale monitoring van individuele dieren mogelijk is. We vinden kopersulfaat onvoldoende om te voorkomen dat wormen vluchten wanneer ze worden blootgesteld aan aversieve interventies die vaak voorkomen in verouderingsonderzoek, waaronder dieetbeperking, pathogene bacteriën en chemische agentia die cellulaire stress veroorzaken. De multi-well apparaten zijn ook gegoten uit polydimethylsiloxaan, dat hoge achtergrondartefacten produceert in fluorescentiebeeldvorming. Dit protocol beschrijft een nieuwe aanpak voor het kweken van geïsoleerde rondwormen op vaste NGM met behulp van in de handel verkrijgbare polystyreenmicrotrays, oorspronkelijk ontworpen voor humane leukocytenantigeenantigeen (HLA) typering, waardoor de overleving, fysiologische fenotypen en fluorescentie gedurende de levensduur kunnen worden gemeten. Een palmitinezuurbarrière voorkomt dat wormen vluchten, zelfs in de aanwezigheid van aversieve omstandigheden. Elke plaat kan tot 96 dieren kweken en past zich gemakkelijk aan verschillende omstandigheden aan, waaronder dieetbeperkingen, RNAi en chemische additieven, en is compatibel met geautomatiseerde systemen voor het verzamelen van levensduur- en activiteitsgegevens.

Introduction

C. elegans zijn een krachtig modelorganisme voor onderzoek in de genetica, cellulaire biologie en moleculaire biologie, omdat ze gemakkelijk in het laboratorium kunnen worden gekweekt, een korte generatietijd en levensduur hebben, een hoge mate van eiwit homologie delen met zoogdieren en een transparante lichaamsstructuur hebben die in vivo visualisatie van fluorescerende eiwitten en kleurstoffen mogelijk maakt¹. Als gevolg van het langdurige gebruik van C. elegans als een belangrijk modelsysteem op een reeks gebieden, waaronder ontwikkelingsbiologie en veroudering, zijn hun groei en ontwikkeling goed begrepen, is hun genoom volledig gesequenced en zijn er een groot aantal krachtige genetische hulpmiddelen gecreëerd, waaronder genoombrede RNAi-voedingsbibliotheken en duizenden mutante en transgene stammen. Historisch gezien worden C. elegans gekweekt als populaties op vaste agarnematodengroeimedia (NGM) en fenotypen worden handmatig geëvalueerd door directe observatie of door beeldvorming en downstream-analyse. Fluorescerende microscopie wordt gebruikt om een verscheidenheid aan moleculaire fenotypes vast te leggen met behulp van kleurstoffen of transgeen tot expressie gebrachte fluorescerende tags in individuele C. elegans. Fluorescerende beeldvorming omvat meestal het fixeren of verlammen van een dier op dia’s met dunne agarose-pads, wat invasief en vaak dodelijk is. Het omvat ook het gebruik van chemicaliën, zoals levamisol of natriumazide, die mogelijk het moleculaire proces van belang kunnen verstoren ^2,3. Samen maken deze benaderingen het mogelijk om cross-sectionele gegevens op populatieniveau te verzamelen over een breed scala aan fenotypen, maar maken ze het niet mogelijk om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen.

In de afgelopen jaren zijn er verschillende benaderingen ontstaan om geïsoleerde C. elegans te cultiveren, waardoor onderzoekers dynamische veranderingen in fysiologische en moleculaire fenotypen van dieren in de loop van de tijd kunnen vastleggen met behulp van nieuwe beeldvormingstechnologieën. Een categorie van C. elegans cultuurbenadering is microfluïdica-apparaten, waaronder WormFarm⁴, de Nemalife-chip⁵ en de ‘gedrags’-chip van Chronis et ^al.6, naast verschillende andere ^7,8,9. Hieraan gerelateerd zijn op vloeistof gebaseerde kweekmethoden, die multi-well platen gebruiken om individuele wormen of kleine populaties in de loop van de tijd te karakteriseren^10,11. Microfluïdica en microplaatsystemen bieden uitstekende kwantitatieve metingen van fenotypische reacties in C. elegans tot een enkel dier, maar de kweekomgeving vertoont een belangrijke beperking. De overgrote meerderheid van het eerdere onderzoek naar C. elegans, met name op het gebied van veroudering, is voltooid op vaste agar-gebaseerde media. Vloeibare cultuur zorgt ervoor dat C. elegans continu zwemmen en vertegenwoordigt een verschillende omgevingscontext die de onderliggende biologie kan veranderen. Dieren gekweekt in vloeibare media hebben bijvoorbeeld het vetgehalte en de genexpressie drastisch veranderd – met name voor genen die betrokken zijn bij de stressrespons – ten opzichte van dieren gekweekt op agar-gebaseerde vaste stof NGM^12,13. Een alternatieve categorie van beeldvormingsmethoden voor één dier omvat polydimethylsiloxaan (PDMS) -apparaten die individuele dieren isoleren op vaste media, in een poging om de standaardomgeving die wordt ervaren door wormen gekweekt op vaste NGM in groepscultuur op petrischolen beter na te bootsen. De WorMotel is een 240-well PDMS-apparaat dat is ontworpen om individuele dieren op vaste media te kweken. Elke put is gevuld met een gemodificeerde NGM met behulp van laagsmeltende agarose in plaats van agar en bezaaid met bacterieel voedsel, waardoor een solide mediaomgeving ontstaat die vergelijkbaar is met het meest voorkomende kweeksysteem met petriplaten. De wanden van de put zijn rond, waardoor elk dier kan worden afgebeeld, ongeacht de locatie in de put (waardoor de visuele verduistering wordt vermeden die wordt veroorzaakt door een dier in de buurt van een muur in een plaat met meerdere putten). Kopersulfaat in een smalle gracht rond elke put wordt gebruikt als afschrikmiddel om dieren in hun putten te houden^14,15. Een beperking van deze aanpak is dat het kopersulfaat niet effectief is in het voorkomen dat wormen vluchten wanneer aversieve omgevingsomstandigheden aanwezig zijn, waaronder dieetbeperking, pathogene bacteriën of chemicaliën die cellulaire stress veroorzaken (bijv. Paraquat).

Een tweede systeem dat vaste media gebruikt, is de Worm Corral, die een hydrogel gebruikt om een kleine afgesloten omgeving te creëren voor elke worm op een dia, waardoor langdurige monitoring van individueel geïsoleerde dieren mogelijk is¹⁶. Een belangrijke beperking is dat dieren als eieren in het milieu moeten worden verzegeld, waardoor het gebruik van steriele dieren vereist is om voortplanting te voorkomen en medicamenteuze behandelingen worden beperkt tot één enkele toepassing. Multi-dosis medicijnproeven kunnen worden bereikt in het WorMotel, hetzij door meerdere blootstellingsrondes uit te voeren voorafgaand aan het overbrengen van wormen naar het apparaat of door tijdens het experiment topisch extra geneesmiddelen aan de putten toe te voegen; In het laatste geval is de werkelijke blootstellingsdosis na het toevoegen van een extra medicijn aan een bestaande put echter moeilijk precies te kwantificeren en hangt het af van hoe snel het medicijn afbreekt. Zowel het WorMotel als de Worm Corral zijn uitstekend geschikt voor brightfield- of darkfield-beeldvorming om informatie vast te leggen met betrekking tot activiteit en dierfysiologie (bijv. Groei en ontwikkeling). Hoewel deze systemen kunnen worden gebruikt om fluorescentie te monitoren, is onze ervaring dat het PDMS dat wordt gebruikt om de andere beeldvormingstechnologieën met één worm te maken, gevoelig voor het vormen van microbubbels, het vastleggen van deeltjes en andere kleine afwijkingen die onregelmatige fluorescerende artefacten genereren die interfereren met consistente fluorescentievisualisatie en kwantificering, vooral in het emissiebereik voor GFP, de meest voorkomende fluorofoor die wordt gebruikt in C. elegans-onderzoek. Tot op heden is live fluorescentiebeeldvorming van C. elegans individuele dieren op een longitudinale manier voornamelijk afhankelijk van microfluïdica-apparaten¹⁷.

Hier beschrijven we een nieuwe methode voor het kweken van individuele C. elegans op vaste media die compatibel is met zowel aversieve interventies als directe fluorescerende beeldvorming. Deze aanpak is qua concept vergelijkbaar met andere beeldvormingstechnologieën met één worm, behalve dat de op maat gemaakte PDMS-chip wordt vervangen door in de handel verkrijgbare polystyreenmicrotrays die oorspronkelijk zijn ontwikkeld voor microcytotoxiciteitstests (ook vaak Terasaki-trays genoemd)¹⁸. Deze microtrays zijn voorzien van putten die kunnen worden gevuld met vaste media en bezaaid met bacterieel voedsel, waarbij de omgeving die dieren ervaren nauw wordt nagebootst volgens de standaard vaste NGM-cultuurmethodologie. Elke put is omgeven door een aversieve barrière van palmitinezuur in plaats van kopersulfaat. Palmitinezuur wordt vaak gebruikt om te voorkomen dat wormen vaste media ontvluchten, met behulp van standaard groepscultuur op petrischlaten in experimenten waarbij wormen worden uitgedaagd met een aversieve omgeving zoals dieetbeperking of blootstelling aan een chemische stressor. De microtrays produceren ook een minimale en consistente fluorescerende achtergrond, waardoor fluorescerende beeldvorming van dieren direct in hun kweekomgeving mogelijk is. Dit nieuwe op vaste agar gebaseerde kweeksysteem voor één dier maakt het niet alleen mogelijk om individuele dieren gedurende het hele leven te volgen en groei, ontwikkeling, activiteit en levensduur te volgen, maar is ook compatibel met directe fluorescerende microscopie. Omdat de wormen kunnen worden afgebeeld zonder verlamming of fixatie, kunnen in vivo fluorescentiebiomarkers longitudinaal worden gekwantificeerd in individuele dieren die op hun kweekmedia blijven, waardoor dynamische veranderingen gedurende de levensduur van elk dier kunnen worden waargenomen. Dit cultuursysteem is ook compatibel met de huidige generatie geautomatiseerde systemen voor het bijhouden van de levensduur en andere gezondheidsstatistieken^14,19. We bieden een gedetailleerd protocol voor het kweken van individuele C. elegans in dit op microtrays gebaseerde systeem, bespreken mogelijke valkuilen en probleemoplossing en bespreken de voordelen en beperkingen ten opzichte van andere systemen, en in het bijzonder een bijgewerkt en geoptimaliseerd WorMotel-protocol¹⁵.

Elke kweekomgeving met één worm bestaat uit een microtray die in een standaard lade met één put is gemonteerd met behulp van een aangepaste 3D-geprinte adapter (figuur 1A). De putten zijn gevuld met laagsmeltende agarose-nematodengroeimedia (lmNGM), bezaaid met geconcentreerde bacteriën als voedselbron en omgeven door een palmitinezuurcoating om te voorkomen dat wormen vluchten (figuur 1B). De ruimte tussen de microtray en de wanden van de single-well plaat is gevuld met verzadigde waterkristallen om de luchtvochtigheid te handhaven (figuur 1B). Op het deksel van de tray wordt een reinigingscoating aangebracht om condensatie te voorkomen. Aan elke put wordt een enkele worm toegevoegd en de lade met één put wordt afgesloten met Parafilm om vocht te behouden en zuurstofuitwisseling mogelijk te maken. Tot zes microtrays kunnen redelijkerwijs parallel worden bereid door een enkele geoefende onderzoeker.

Protocol

1. Recepten OPMERKING: Bereid voorraadoplossingen voor voordat u begint met de voorbereiding van microtrayplaten. Voorraadoplossingen voor laagsmeltende agarose-nematodengroeimedia (lmNGM)Bereid 1 MK2 HPO4 door 174,18 g K2HPO4 op te lossen in 1 L steriel gedeïoniseerd water in een fles van 1 L. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psi, gedurende 30 minuten en bewaar deze bij kamertemperatuur (RT). Bereid 1 M KP<s…

Representative Results

De microtray-gebaseerde single-worm kweekomgeving die hier wordt beschreven, kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan fenotypen te volgen, waaronder levensduur en gezondheidsspanne, activiteit en beweging, lichaamsvorm en kruipgeometrie, en de expressie van transgeen tot expressie gebrachte fluorescerende biomarkers in individuele dieren in de loop van de tijd. Het microtray-kweeksysteem is compatibel met levensduuranalyse door middel van handmatige scoring of beeldverzameling en downstream beeldanalyse. Net als bi…

Discussion

Hier beschrijven we een nieuw kweeksysteem dat microtrays aanpast, oorspronkelijk ontwikkeld voor menselijke leukocytenantigeenweefseltyperingstests, om de isolatie en karakterisering van enkele C. elegans in de loop van de tijd mogelijk te maken in een solide mediaomgeving die contextueel vergelijkbaar is met de op agar gebaseerde NGM die de standaard is in C. elegans-onderzoek. Dit systeem is compatibel met een verscheidenheid aan interventies, waaronder dieetbeperking, exogene medicamenteuze behand…

Materials

3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP