Coltura a lungo termine di singoli Caenorhabditis elegans su terreni solidi per il monitoraggio longitudinale della fluorescenza e interventi avversivi

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura di singoli nematodi isolati su terreni solidi per il monitoraggio dei parametri fisiologici permanenti e la quantificazione della fluorescenza. Questo sistema di coltura include una barriera di acido palmitico attorno ai pozzi a singolo verme per impedire agli animali di fuggire, consentendo l’uso di interventi avversivi, inclusi batteri patogeni e fattori di stress chimici.

Abstract

Caenorhabditis elegans sono ampiamente utilizzati per studiare la biologia dell’invecchiamento. La pratica standard negli studi sull’invecchiamento di C. elegans è quella di coltivare gruppi di vermi su terreni di crescita di nematodi solidi (NGM), consentendo la raccolta efficiente di dati a livello di popolazione per la sopravvivenza e altri fenotipi fisiologici e il campionamento periodico delle sottopopolazioni per la quantificazione dei biomarcatori fluorescenti. I limiti di questo approccio sono l’incapacità di (1) seguire i singoli vermi nel tempo per sviluppare traiettorie di età per fenotipi di interesse e (2) monitorare biomarcatori fluorescenti direttamente nel contesto dell’ambiente di coltura. Gli approcci di coltura alternativi utilizzano la coltura liquida o la microfluidica per monitorare i singoli animali nel tempo, in alcuni casi inclusa la quantificazione della fluorescenza, con il compromesso che l’ambiente di coltura è contestualmente distinto dal NGM solido. Il WorMotel è un dispositivo multi-pozzo microfabbricato precedentemente descritto per la coltura di vermi isolati su NGM solido. Ogni verme è mantenuto in un pozzo contenente NGM solido circondato da un fossato riempito di solfato di rame, un repellente da contatto per C. elegans, che consente il monitoraggio longitudinale dei singoli animali. Troviamo che il solfato di rame non è sufficiente per impedire ai vermi di fuggire quando sottoposti a interventi avversivi comuni nella ricerca sull’invecchiamento, tra cui restrizioni dietetiche, batteri patogeni e agenti chimici che inducono stress cellulare. I dispositivi multi-pozzetto sono anche stampati da polidimetilsilossano, che produce artefatti di fondo elevati nell’imaging a fluorescenza. Questo protocollo descrive un nuovo approccio per la coltura di nematodi isolati su NGM solido utilizzando microvassoi di polistirene disponibili in commercio, originariamente progettati per la tipizzazione dell’antigene leucocitario umano (HLA), consentendo la misurazione della sopravvivenza, dei fenotipi fisiologici e della fluorescenza per tutta la durata della vita. Una barriera di acido palmitico impedisce ai vermi di fuggire, anche in presenza di condizioni avverse. Ogni piastra può coltivare fino a 96 animali e si adatta facilmente a una varietà di condizioni, tra cui restrizioni dietetiche, RNAi e additivi chimici, ed è compatibile con i sistemi automatizzati per la raccolta di dati sulla durata della vita e sull’attività.

Introduction

C. elegans è un potente organismo modello per la ricerca in genetica, biologia cellulare e biologia molecolare, perché sono facilmente coltivabili in laboratorio, hanno un breve tempo di generazione e durata della vita, condividono un alto grado di omologia proteica con i mammiferi e hanno una struttura corporea trasparente che consente la visualizzazione in vivo di proteine fluorescenti e coloranti¹. Come risultato dell’uso di lunga data di C. elegans come importante sistema modello in una serie di campi, tra cui la biologia dello sviluppo e l’invecchiamento, la loro crescita e sviluppo sono ben compresi, il loro genoma è stato completamente sequenziato e sono stati creati una serie di potenti strumenti genetici, tra cui librerie di alimentazione RNAi a livello di genoma e migliaia di ceppi mutanti e transgenici. Storicamente, i C. elegans sono coltivati come popolazioni su terreni di crescita solidi di nematodi agar (NGM) e i fenotipi sono valutati manualmente mediante osservazione diretta o mediante imaging e analisi a valle. La microscopia fluorescente viene utilizzata per catturare una varietà di fenotipi molecolari utilizzando coloranti o tag fluorescenti espressi transgenicamente in singoli C. elegans. L’imaging fluorescente comporta tipicamente il fissaggio o la paralisi di un animale su vetrini contenenti sottili cuscinetti di agarosio, che è invasivo e spesso letale. Comporta anche l’uso di sostanze chimiche, come il levamisolo o l’azoturo di sodio, che possono potenzialmente interferire con il processo molecolare di interesse ^2,3. Insieme, questi approcci consentono di raccogliere dati trasversali a livello di popolazione su un’ampia gamma di fenotipi, ma non consentono il monitoraggio dei singoli animali nel tempo.

Negli ultimi anni, sono emersi diversi approcci per coltivare C. elegans isolati, consentendo ai ricercatori di catturare i cambiamenti dinamici nei fenotipi fisiologici e molecolari degli animali nel tempo utilizzando nuove tecnologie di imaging. Una categoria di approccio colturale di C. elegans sono i dispositivi microfluidici, tra cui WormFarm⁴, il chip Nemalife⁵ e il chip “behavior” di Chronis et ^al.6, tra i vari altri ^7,8,9. Correlati a questi sono metodi di coltura a base liquida, che utilizzano piastre multi-pozzetto per caratterizzare singoli vermi o piccole popolazioni nel tempo^10,11. I sistemi di microfluidica e micropiastre forniscono eccellenti misurazioni quantitative delle risposte fenotipiche in C. elegans fino a un singolo animale, ma l’ambiente di coltura presenta una limitazione chiave. La stragrande maggioranza delle ricerche passate su C. elegans, in particolare nel campo dell’invecchiamento, è stata completata su terreni solidi a base di agar. La coltura liquida fa sì che C. elegans nuoti continuamente e rappresenti un contesto ambientale distinto che può alterare la biologia sottostante. Ad esempio, gli animali allevati in terreni liquidi hanno drasticamente alterato il contenuto di grassi e l’espressione genica – in particolare per i geni coinvolti nella risposta allo stress – rispetto agli animali coltivati su NGM solido^12,13 a base di agar. Una categoria alternativa di metodi di imaging per singolo animale coinvolge dispositivi di polidimetilsilossano (PDMS) che isolano i singoli animali su supporti solidi, nel tentativo di imitare più da vicino l’ambiente standard sperimentato dai vermi coltivati su NGM solido in coltura di gruppo su piastre di Petri. Il WorMotel è un dispositivo PDMS a 240 pozzetti progettato per allevare singoli animali su supporti solidi. Ogni pozzetto è riempito con un NGM modificato utilizzando agarosio a basso punto di fusione al posto dell’agar e seminato con cibo batterico, creando un ambiente solido simile al sistema di coltura più comune che utilizza piastre di Petri. Le pareti del pozzo sono rotonde, consentendo a ciascun animale di essere ripreso indipendentemente dalla posizione nel pozzo (evitando l’oscuramento visivo causato da un animale vicino a un muro in una piastra multi-pozzo). Il solfato di rame in uno stretto fossato che circonda ogni pozzo è usato come deterrente per mantenere gli animali nei loro pozzi^14,15. Una limitazione di questo approccio è che il solfato di rame è inefficace nel prevenire la fuga dei vermi quando sono presenti condizioni ambientali avverse, tra cui restrizioni dietetiche, batteri patogeni o sostanze chimiche che inducono stress cellulare (ad esempio, paraquat).

Un secondo sistema che utilizza mezzi solidi è il Worm Corral, che impiega un idrogel per creare un piccolo ambiente sigillato per ogni verme su un vetrino, consentendo il monitoraggio a lungo termine di animali isolati individualmente¹⁶. Una limitazione chiave è che gli animali devono essere sigillati nell’ambiente come uova, richiedendo l’uso di animali sterili per prevenire la riproduzione e limitando i trattamenti farmacologici a una singola applicazione. Le sperimentazioni multidose di farmaci possono essere eseguite nel WorMotel conducendo più cicli di esposizione prima di trasferire i vermi al dispositivo o aggiungendo localmente ulteriori farmaci ai pozzetti durante l’esperimento; Tuttavia, in quest’ultimo caso, la dose di esposizione effettiva dopo l’aggiunta di un farmaco aggiuntivo a un pozzetto esistente è difficile da quantificare con precisione e dipende dalla rapidità con cui il farmaco si degrada. Sia il WorMotel che il Worm Corral sono eccellenti per l’imaging in campo chiaro o in campo oscuro per acquisire informazioni relative all’attività e alla fisiologia animale (ad esempio, crescita e sviluppo). Mentre questi sistemi possono essere utilizzati per monitorare la fluorescenza, nella nostra esperienza, il PDMS utilizzato per creare le altre tecnologie di imaging a singolo verme è incline a formare microbolle, catturare il particolato e altre piccole anomalie che generano artefatti fluorescenti irregolari che interferiscono con la visualizzazione e la quantificazione della fluorescenza coerente, specialmente nell’intervallo di emissione per GFP, il fluoroforo più comune utilizzato nella ricerca su C. elegans. Ad oggi, l’imaging a fluorescenza vivo di singoli animali di C. elegans in modo longitudinale si basa principalmente su dispositivi microfluidici¹⁷.

Qui, descriviamo un nuovo metodo per la coltura di singoli C. elegans su supporti solidi che è compatibile sia con gli interventi avversivi che con l’imaging fluorescente diretto. Questo approccio è concettualmente simile ad altre tecnologie di imaging a singolo verme, tranne per il fatto che il chip PDMS stampato su misura viene sostituito con microvassoi in polistirene disponibili in commercio originariamente sviluppati per saggi di microcitotossicità (comunemente chiamati anche vassoi Terasaki)¹⁸. Questi microvassoi sono dotati di pozzetti che possono essere riempiti con terreni solidi e seminati con cibo batterico, imitando da vicino l’ambiente sperimentato dagli animali con la metodologia standard di coltura NGM solida. Ogni pozzetto è circondato da una barriera avversiva di acido palmitico piuttosto che di solfato di rame. L’acido palmitico è comunemente usato per impedire ai vermi di fuggire dai mezzi solidi, utilizzando la coltura di gruppo standard su piastre di Petri in esperimenti in cui i vermi sono sfidati con un ambiente avversivo come la restrizione dietetica o l’esposizione a un fattore di stress chimico. I microvassoi producono anche uno sfondo fluorescente minimo e coerente, consentendo l’imaging fluorescente degli animali direttamente nel loro ambiente di coltura. Questo nuovo sistema di coltura a base di agar solido per singolo animale non solo consente di tracciare i singoli animali per tutta la vita e monitorare la crescita, lo sviluppo, l’attività e la durata della vita, ma è anche compatibile con la microscopia fluorescente diretta. Poiché i vermi possono essere fotografati senza paralisi o fissazione, i biomarcatori di fluorescenza in vivo possono essere quantificati longitudinalmente nei singoli animali che rimangono sui loro terreni di coltura, consentendo l’osservazione dei cambiamenti dinamici nel corso della vita di ciascun animale. Questo sistema di coltura è anche compatibile con i sistemi automatizzati di attuale generazione per il monitoraggio della durata della vita e altre metriche sanitarie^14,19. Forniamo un protocollo dettagliato per la coltura di singoli C. elegans in questo sistema basato su microvassoi, discutiamo potenziali insidie e risoluzione dei problemi e discutiamo i vantaggi e le limitazioni relativi ad altri sistemi e, in particolare, un protocollo WorMotel aggiornato e ottimizzato¹⁵.

Ogni ambiente di coltura a singolo verme è costituito da un microvassoio montato all’interno di un vassoio standard a pozzetto singolo utilizzando un adattatore personalizzato stampato in 3D (Figura 1A). I pozzetti sono riempiti con terreni di crescita di nematodi agarosio a basso punto di fusione (lmNGM), seminati con batteri concentrati come fonte di cibo e circondati da un rivestimento di acido palmitico per impedire ai vermi di fuggire (Figura 1B). Lo spazio tra il microvassoio e le pareti della piastra a pozzetto singolo è riempito con cristalli di acqua satura per mantenere l’umidità (Figura 1B). Un rivestimento detergente viene applicato al coperchio del vassoio per evitare la formazione di condensa. Un singolo verme viene aggiunto a ciascun pozzetto e il vassoio a pozzetto singolo viene sigillato con Parafilm per mantenere l’umidità e consentire lo scambio di ossigeno. Fino a sei microvassoi possono ragionevolmente essere preparati in parallelo da un singolo ricercatore praticato.

Protocol

1. Ricette NOTA: Preparare le soluzioni stock prima di iniziare la preparazione della piastra del microvassoio. Soluzioni stock per terreni di crescita di nematodi agarosio a basso punto di fusione (lmNGM)Preparare 1 M K 2 HPO4 sciogliendo 174,18 g di K2HPO4 in 1 Ldi acqua deionizzata sterile in una bottiglia da 1 L. Autoclavare la soluzione a 121 °C, 15 psi, per 30 minuti e conservarla a temperatura ambiente (RT). <li…

Representative Results

L’ambiente di coltura a singolo verme basato su microvassoi qui descritto può essere utilizzato per monitorare una varietà di fenotipi, tra cui durata della vita e durata della salute, attività e movimento, forma del corpo e geometria strisciante e l’espressione di biomarcatori fluorescenti espressi transgenicamente nei singoli animali nel tempo. Il sistema di coltura microtray è compatibile con l’analisi della durata di vita attraverso il punteggio manuale o la raccolta di immagini e l’analisi di imaging a valle. Co…

Discussion

Qui, descriviamo un nuovo sistema di coltura che adatta i microvassoi, originariamente sviluppati per i saggi di tipizzazione del tessuto dell’antigene leucocitario umano, per consentire l’isolamento e la caratterizzazione di singoli C. elegans nel tempo in un ambiente di media solidi che è contestualmente simile all’NGM basato su agar che è lo standard nella ricerca su C. elegans. Questo sistema è compatibile con una varietà di interventi, tra cui la restrizione dietetica, il trattamento farmacol…

Materials

3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP