Долгосрочное культивирование отдельных Caenorhabditis elegans на твердых средах для продольного флуоресцентного мониторинга и аверсивных вмешательств

Summary

Здесь мы представляем протокол культивирования изолированных отдельных нематод на твердых средах для отслеживания физиологических параметров на протяжении всей жизни и количественной оценки флуоресценции. Эта система культивирования включает в себя барьер пальмитиновой кислоты вокруг лунок с одним червяком, чтобы предотвратить бегство животных, что позволяет использовать аверсивные вмешательства, включая патогенные бактерии и химические стрессоры.

Abstract

Caenorhabditis elegans широко используются для изучения биологии старения. Стандартной практикой в исследованиях старения C. elegans является культивирование групп червей на твердых средах для роста нематод (NGM), что позволяет эффективно собирать данные на уровне популяции для выживания и других физиологических фенотипов, а также периодический отбор проб субпопуляций для количественной оценки флуоресцентных биомаркеров. Ограничениями этого подхода являются неспособность (1) следить за отдельными червями с течением времени для развития возрастных траекторий для интересующих фенотипов и (2) контролировать флуоресцентные биомаркеры непосредственно в контексте культуральной среды. Альтернативные подходы к культивированию используют жидкую культуру или микрофлюидики для мониторинга отдельных животных с течением времени, в некоторых случаях включая количественную оценку флуоресценции, с компромиссом, заключающимся в том, что культурная среда контекстуально отличается от твердого NGM. WorMotel представляет собой ранее описанное микрофабрикованное многолуночное устройство для культивирования изолированных червей на твердых NGM. Каждый червь содержится в колодце, содержащем твердый NGM, окруженный рвом, заполненным сульфатом меди, контактным репеллентом для C. elegans, позволяющим проводить продольный мониторинг отдельных животных. Мы считаем, что сульфата меди недостаточно, чтобы предотвратить бегство червей при воздействии аверсивных вмешательств, распространенных в исследованиях старения, включая ограничения в питании, патогенные бактерии и химические агенты, вызывающие клеточный стресс. Многолуночные устройства также отлиты из полидиметилсилоксана, который создает артефакты с высоким фоном при флуоресцентной визуализации. Этот протокол описывает новый подход к культивированию изолированных круглых червей на твердых NGM с использованием коммерчески доступных полистирольных микролотков, первоначально разработанных для типирования лейкоцитарного антигена человека (HLA), что позволяет измерять выживаемость, физиологические фенотипы и флуоресценцию на протяжении всей жизни. Барьер пальмитиновой кислоты предотвращает бегство червей даже при наличии аверсивных состояний. Каждая пластина может культивировать до 96 животных и легко адаптируется к различным условиям, включая диетические ограничения, РНКи и химические добавки, и совместима с автоматизированными системами сбора данных о продолжительности жизни и активности.

Introduction

C. elegans являются мощным модельным организмом для исследований в области генетики, клеточной биологии и молекулярной биологии, поскольку они легко культивируются в лаборатории, имеют короткое время генерации и продолжительность жизни, имеют высокую степень гомологии белка с млекопитающими и имеют прозрачную структуру тела, которая позволяет in vivo визуализировать флуоресцентные белки и красители¹. В результате многолетнего использования C. elegans в качестве основной модельной системы в ряде областей, включая биологию развития и старение, их рост и развитие хорошо изучены, их геном был полностью секвенирован, и было создано множество мощных генетических инструментов, включая полногеномные библиотеки питания РНК-интерференции и тысячи мутантных и трансгенных штаммов. Исторически сложилось так, что C. elegans культивируются как популяции на твердых агаровых нематодных питательных средах (NGM), а фенотипы оцениваются вручную либо путем прямого наблюдения, либо путем визуализации и последующего анализа. Флуоресцентная микроскопия используется для захвата различных молекулярных фенотипов с использованием красителей или трансгенно экспрессируемых флуоресцентных меток у отдельных C. elegans. Флуоресцентная визуализация обычно включает в себя фиксацию или парализацию животного на предметных стеклах, содержащих тонкие агарозные подушечки, что является инвазивным и часто смертельным. Он также включает использование химических веществ, таких как левамизол или азид натрия, которые потенциально могут вмешиваться в молекулярный процесс, представляющий интерес ^2,3. Вместе эти подходы позволяют собирать перекрестные данные на уровне популяции по широкому спектру фенотипов, но не позволяют отслеживать отдельных животных с течением времени.

В последние годы появилось несколько подходов к культивированию изолированных C. elegans, что позволяет исследователям фиксировать динамические изменения физиологических и молекулярных фенотипов животных с течением времени с использованием новых технологий визуализации. Одной из категорий подхода к культуре C. elegans являются микрофлюидные устройства, в том числе WormFarm⁴, чип Nemalife⁵ и чип «поведения» Chronis et ^al.6, а также различные другие 7,8,9. С ними связаны методы культивирования на основе жидкости, в которых используются многолуночные планшеты для характеристики отдельных червей или небольших популяций с течением времени^10,11. Микрофлюидика и микропланшетные системы обеспечивают отличные количественные измерения фенотипических реакций у C. elegans вплоть до одного животного, но культуральная среда представляет собой ключевое ограничение. Подавляющее большинство прошлых исследований C. elegans, особенно в области старения, было завершено на твердых средах на основе агара. Жидкая культура заставляет C. elegans непрерывно плавать и представляет собой особый экологический контекст, который может изменить лежащую в основе биологию. Например, у животных, культивируемых в жидких средах, резко изменилось содержание жира и экспрессия генов, особенно генов, участвующих в реакции на стресс, по сравнению с животными, культивируемыми на твердом веществе NGM^12,13 на основе агара. Альтернативная категория методов визуализации на одном животном включает устройства из полидиметилсилоксана (PDMS), которые изолируют отдельных животных на твердых средах, чтобы более точно имитировать стандартную среду, в которой находятся черви, культивируемые на твердых NGM в групповой культуре на пластинах Петри. WorMotel – это 240-луночное устройство PDMS, предназначенное для культивирования отдельных животных на твердых средах. Каждая лунка заполняется модифицированным NGM с использованием низкоплавкой агарозы вместо агара и засевается бактериальной пищей, создавая твердую среднюю среду, аналогичную наиболее распространенной системе культивирования с использованием пластин Петри. Стенки колодца круглые, что позволяет визуализировать каждое животное независимо от его местоположения в колодце (избегая визуального затемнения, вызванного животным возле стены в многолуночной пластине). Медный купорос в узком рву, окружающем каждый колодец, используется в качестве отпугивающего фактора для содержания животных в их колодцах^14,15. Ограничением этого подхода является то, что сульфат меди неэффективен для предотвращения бегства червей при наличии неблагоприятных условий окружающей среды, включая диетические ограничения, патогенные бактерии или химические вещества, вызывающие клеточный стресс (например, паракват).

Второй системой, в которой используются твердые среды, является загон для червей, в котором используется гидрогель для создания небольшой герметичной среды для каждого червя на предметном стекле, что позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг индивидуально изолированных животных¹⁶. Ключевым ограничением является то, что животные должны быть запечатаны в окружающую среду в виде яиц, что требует использования стерильных животных для предотвращения размножения и ограничивает лекарственное лечение одним применением. Испытания многодозовых лекарств могут быть выполнены в WorMotel либо путем проведения нескольких раундов воздействия перед переносом червей в устройство, либо путем местного добавления дополнительных лекарств в лунки во время эксперимента; Однако в последнем случае фактическая доза воздействия после добавления дополнительного лекарственного средства в существующую лунку трудно поддается точному количественному определению и зависит от того, насколько быстро лекарство разлагается. И WorMotel, и Worm Corral отлично подходят для визуализации светлого или темного поля для сбора информации, связанной с активностью и физиологией животных (например, ростом и развитием). Хотя эти системы могут быть использованы для мониторинга флуоресценции, по нашему опыту, PDMS, используемая для создания других технологий визуализации с одним червем, склонна к образованию микропузырьков, улавливанию твердых частиц и другим небольшим аномалиям, которые генерируют нерегулярные флуоресцентные артефакты, которые мешают последовательной визуализации флуоресценции и количественной оценке, особенно в диапазоне излучения для GFP, наиболее распространенного флуорофора, используемого в исследованиях C. elegans. На сегодняшний день живая флуоресцентная визуализация отдельных животных C. elegans в продольном направлении в основном опирается на микрофлюидные устройства¹⁷.

Здесь мы описываем новый метод культивирования отдельных C. elegans на твердых средах, который совместим как с аверсивными вмешательствами, так и с прямой флуоресцентной визуализацией. Этот подход аналогичен по концепции другим технологиям визуализации с одним червем, за исключением того, что изготовленный по индивидуальному заказу чип PDMS заменяется коммерчески доступными полистирольными микролотками, первоначально разработанными для анализов микроцитотоксичности (также обычно называемыми лотками Терасаки)¹⁸. Эти микролотки имеют лунки, которые могут быть заполнены твердой средой и засеяны бактериальной пищей, точно имитирующей среду, в которой находятся животные в соответствии со стандартной методологией культивирования твердых NGM. Каждая скважина окружена аверсивным барьером из пальмитиновой кислоты, а не медного купороса. Пальмитиновая кислота обычно используется для предотвращения выхода червей из твердых сред, используя стандартную групповую культуру на пластинах Петри в экспериментах, где черви подвергаются воздействию неприятной среды, такой как диетические ограничения или воздействие химического стрессора. Микролотки также создают минимальный и стабильный флуоресцентный фон, что позволяет получать флуоресцентные изображения животных непосредственно в их культурной среде. Эта новая система культивирования на основе твердого агара для одного животного не только позволяет отслеживать отдельных животных на протяжении всей жизни и контролировать рост, развитие, активность и продолжительность жизни, но также совместима с прямой флуоресцентной микроскопией. Поскольку черви могут быть визуализированы без паралича или фиксации, биомаркеры флуоресценции in vivo могут быть количественно количественно определены в продольном направлении у отдельных животных, оставшихся на их питательных средах, что позволяет наблюдать динамические изменения в течение жизни каждого животного. Эта система культивирования также совместима с автоматизированными системами текущего поколения для отслеживания продолжительности жизни и других показателей здоровья^14,19. Мы предоставляем подробный протокол культивирования отдельных C. elegans в этой системе на основе микролотков, обсуждаем потенциальные подводные камни и устранение неполадок, а также обсуждаем преимущества и ограничения по сравнению с другими системами и, в частности, обновленный и оптимизированный протокол WorMotel¹⁵.

Каждая среда для культивирования одного червя состоит из микролотка, установленного внутри стандартного однолуночного лотка с помощью специального адаптера, напечатанного на 3D-принтере (рис. 1A). Лунки заполнены питательной средой из низкоплавкой агарозной нематоды (lmNGM), засеяны концентрированными бактериями в качестве источника пищи и окружены оболочкой из пальмитиновой кислоты для предотвращения бегства червей (рис. 1B). Пространство между микролотком и стенками однолунковой пластины заполняется насыщенными кристаллами воды для поддержания влажности (рис. 1Б). На крышку лотка наносится моющее покрытие для предотвращения образования конденсата. В каждую лунку добавляется по одному червяку, а однолуночный лоток герметизируется Parafilm для поддержания влажности и обеспечения кислородного обмена. До шести микролотков могут быть подготовлены параллельно одним практикующим исследователем.

Protocol

1. Рецепты ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте исходные растворы перед началом подготовки пластин для микролотков. Исходные растворы для низкоплавких сред для роста агарозных нематод (lmNGM)Приготовьте 1 М К 2 ГПО4, растворив 174,18 г К2ХПО4 в1 л стерильн?…

Representative Results

Описанная здесь среда культивирования одного червя на основе микролотка может быть использована для мониторинга различных фенотипов, включая продолжительность жизни и продолжительность здоровья, активность и движение, форму тела и геометрию ползания, а также экспрессию трансгенно э…

Discussion

Здесь мы описываем новую культуральную систему, которая адаптирует микролотки, первоначально разработанные для анализов типирования тканей на лейкоцитарный антиген человека, чтобы обеспечить изоляцию и характеристику отдельных C. elegans с течением времени в среде твердой среды, котора?…

Materials

3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP