Här presenterar vi ett protokoll för att odla isolerade enskilda nematoder på fasta medier för livslång fysiologisk parameterspårning och fluorescenskvantifiering. Detta odlingssystem inkluderar en palmitinsyrabarriär runt enmaskbrunnar för att förhindra att djur flyr, vilket möjliggör användning av aversiva ingrepp, inklusive patogena bakterier och kemiska stressfaktorer.
Caenorhabditis elegans används ofta för att studera åldrande biologi. Standardpraxis i C. elegans åldringsstudier är att odla grupper av maskar på fasta nematodtillväxtmedier (NGM), vilket möjliggör effektiv insamling av data på populationsnivå för överlevnad och andra fysiologiska fenotyper, och periodisk provtagning av subpopulationer för fluorescerande biomarkörkvantifiering. Begränsningar för detta tillvägagångssätt är oförmågan att (1) följa enskilda maskar över tid för att utveckla åldersbanor för fenotyper av intresse och (2) övervaka fluorescerande biomarkörer direkt i samband med odlingsmiljön. Alternativa odlingsmetoder använder flytande kultur eller mikrofluidik för att övervaka enskilda djur över tid, i vissa fall inklusive fluorescenskvantifiering, med avvägningen att odlingsmiljön är kontextuellt skild från fast NGM. WorMotel är en tidigare beskriven mikrofabricerad flerbrunnsanordning för odling av isolerade maskar på fast NGM. Varje mask hålls i en brunn innehållande fast NGM omgiven av en vallgrav fylld med kopparsulfat, ett kontaktavvisande medel för C. elegans, vilket möjliggör longitudinell övervakning av enskilda djur. Vi finner kopparsulfat otillräckligt för att förhindra maskar från att fly när de utsätts för aversiva ingrepp som är vanliga i åldrande forskning, inklusive kostbegränsning, patogena bakterier och kemiska medel som inducerar cellulär stress. Multibrunnsanordningarna är också gjutna av polydimetylsiloxan, vilket ger höga bakgrundsartefakter vid fluorescensavbildning. Detta protokoll beskriver ett nytt tillvägagångssätt för odling av isolerade rundmaskar på fast NGM med kommersiellt tillgängliga polystyrenmikrobrickor, ursprungligen utformade för humant leukocytantigen (HLA) typning, vilket möjliggör mätning av överlevnad, fysiologiska fenotyper och fluorescens över livslängden. En palmitinsyrabarriär hindrar maskar från att fly, även i närvaro av aversiva förhållanden. Varje platta kan odla upp till 96 djur och anpassar sig enkelt till en mängd olika förhållanden, inklusive kostbegränsning, RNAi och kemiska tillsatser, och är kompatibel med automatiserade system för insamling av livslängds- och aktivitetsdata.
C. elegans är en kraftfull modellorganism för forskning inom genetik, cellbiologi och molekylärbiologi, eftersom de lätt odlas i laboratoriet, har en kort generationstid och livslängd, delar en hög grad av proteinhomologi med däggdjur och har en transparent kroppsstruktur som möjliggör in vivo-visualisering av fluorescerande proteiner och färgämnen1. Som ett resultat av den långvariga användningen av C. elegans som ett viktigt modellsystem inom en rad områden, inklusive utvecklingsbiologi och åldrande, är deras tillväxt och utveckling väl förstådd, deras genom har sekvenserats fullständigt och en mängd kraftfulla genetiska verktyg har skapats, inklusive genomomfattande RNAi-matningsbibliotek och tusentals mutanta och transgena stammar. Historiskt odlas C. elegans som populationer på tillväxtmedier för fast agarnematod (NGM), och fenotyper utvärderas manuellt antingen genom direkt observation eller genom avbildning och nedströmsanalys. Fluorescerande mikroskopi används för att fånga en mängd olika molekylära fenotyper med färgämnen eller transgent uttryckta fluorescerande taggar i enskilda C. elegans. Fluorescerande avbildning innebär vanligtvis att fixera eller förlama ett djur på objektglas som innehåller tunna agaroskuddar, vilket är invasivt och ofta dödligt. Det innebär också användning av kemikalier, såsom levamisol eller natriumazid, som potentiellt kan störa den molekylära processen av intresse 2,3. Tillsammans tillåter dessa tillvägagångssätt tvärsnittsdata på populationsnivå som ska samlas in över ett brett spektrum av fenotyper, men tillåter inte spårning av enskilda djur över tid.
Under de senaste åren har flera metoder uppstått för att odla isolerade C. elegans, vilket gör det möjligt för forskare att fånga dynamiska förändringar i fysiologiska och molekylära fenotyper av djur över tid med hjälp av ny bildteknik. En kategori av C. elegans kulturmetod är mikrofluidikanordningar, inklusive WormFarm4, Nemalife-chipet5 och “beteende” -chipet av Chronis et al.6, bland olika andra 7,8,9. Relaterade till dessa är vätskebaserade odlingsmetoder, som använder flerbrunnsplattor för att karakterisera enskilda maskar eller små populationer över tiden10,11. Mikrofluidik och mikroplattsystem ger utmärkta kvantitativa mätningar av fenotypiska svar i C. elegans ner till ett enda djur, men odlingsmiljön utgör en viktig begränsning. Den stora majoriteten av tidigare forskning inom C. elegans, särskilt inom åldrande, har slutförts på fasta agarbaserade medier. Flytande kultur får C. elegans att simma kontinuerligt och representerar ett distinkt miljösammanhang som kan förändra den underliggande biologin. Till exempel har djur som odlats i flytande media drastiskt förändrat fettinnehåll och genuttryck – särskilt för gener som är involverade i stressresponsen – i förhållande till djur som odlas på agarbaserad fast NGM12,13. En alternativ kategori av avbildningsmetoder för enstaka djur innefattar polydimetylsiloxan (PDMS) -anordningar som isolerar enskilda djur på fasta medier, i ett försök att närmare efterlikna standardmiljön som upplevs av maskar odlade på fast NGM i gruppkultur på Petri-plattor. WorMotel är en 240-brunns PDMS-enhet utformad för att odla enskilda djur på fasta medier. Varje brunn fylls med en modifierad NGM med lågsmält agaros i stället för agar och sås med bakteriell mat, vilket skapar en fast mediemiljö som liknar det vanligaste odlingssystemet med Petri-plattor. Brunnsväggarna är runda, vilket gör att varje djur kan avbildas oavsett plats i brunnen (undvik den visuella skymningen orsakad av ett djur nära en vägg i en flerbrunnsplatta). Kopparsulfat i en smal vallgrav som omger varje brunn används som avskräckande medel för att hålla djur i sina brunnar14,15. En begränsning av detta tillvägagångssätt är att kopparsulfatet är ineffektivt för att förhindra maskar från att fly när aversiva miljöförhållanden är närvarande, inklusive kostbegränsning, patogena bakterier eller kemikalier som inducerar cellulär stress (t.ex. parakvat).
Ett andra system som använder fasta medier är Worm Corral, som använder en hydrogel för att skapa en liten förseglad miljö för varje mask på ett objektglas, vilket möjliggör långsiktig övervakning av individuellt isolerade djur16. En viktig begränsning är att djur måste förseglas i miljön som ägg, vilket kräver användning av sterila djur för att förhindra reproduktion och begränsar läkemedelsbehandlingar till en enda applikation. Läkemedelsprövningar med flera doser kan utföras i WorMotel antingen genom att utföra flera exponeringsomgångar innan maskar överförs till enheten eller genom att lokalt tillsätta ytterligare läkemedel till brunnarna under experimentet. I det senare fallet är emellertid den faktiska exponeringsdosen efter tillsats av ytterligare ett läkemedel till en befintlig brunn svår att exakt kvantifiera och beror på hur snabbt läkemedlet bryts ned. Både WorMotel och Worm Corral är utmärkta för ljusfälts- eller mörkfältsavbildning för att fånga information relaterad till aktivitet och djurfysiologi (t.ex. tillväxt och utveckling). Även om dessa system kan användas för att övervaka fluorescens, är PDMS som används för att skapa andra enkelmaskavbildningstekniker enligt vår erfarenhet benägna att bilda mikrobubblor, fånga partiklar och andra små avvikelser som genererar oregelbundna fluorescerande artefakter som stör konsekvent fluorescensvisualisering och kvantifiering, särskilt i emissionsområdet för GFP, den vanligaste fluoroforen som används i C. elegans forskning. Hittills är levande fluorescensavbildning av C. elegans enskilda djur på ett longitudinellt sätt främst beroende av mikrofluidikanordningar17.
Här beskriver vi en ny metod för odling av enskilda C. elegans på fasta medier som är kompatibel med både aversiva interventioner och direkt fluorescerande avbildning. Detta tillvägagångssätt liknar konceptet för andra avbildningstekniker med en mask, förutom att det specialgjutna PDMS-chipet ersätts med kommersiellt tillgängliga mikrobrickor av polystyren som ursprungligen utvecklades för mikrocytotoxicitetsanalyser (även vanligen kallade Terasaki-brickor)18. Dessa mikrobrickor har brunnar som kan fyllas med fasta medier och sås med bakteriell mat, vilket nära efterliknar miljön som upplevs av djur under standard fast NGM-odlingsmetodik. Varje brunn är omgiven av en aversiv barriär av palmitinsyra snarare än kopparsulfat. Palmitinsyra används ofta för att förhindra maskar från att fly från fasta medier, med hjälp av standardgruppkultur på Petri-plattor i experiment där maskar utmanas med en aversiv miljö som kostbegränsning eller exponering för en kemisk stressor. Mikrobrickorna producerar också minimal och konsekvent fluorescerande bakgrund, vilket möjliggör fluorescerande avbildning av djur direkt i deras odlingsmiljö. Detta nya solida agarbaserade odlingssystem för ett djur gör det inte bara möjligt att spåra enskilda djur under hela livet och övervaka tillväxt, utveckling, aktivitet och livslängd, utan är också kompatibelt med direkt fluorescerande mikroskopi. Eftersom maskarna kan avbildas utan förlamning eller fixering kan fluorescensbiomarkörer in vivo kvantifieras longitudinellt hos enskilda djur som finns kvar på deras odlingssubstrat, vilket möjliggör observation av dynamiska förändringar under varje djurs livstid. Detta odlingssystem är också kompatibelt med nuvarande generationens automatiserade system för spårning av livslängd och andra hälsomått14,19. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för odling av enskilda C. elegans i detta mikrobrickbaserade system, diskuterar potentiella fallgropar och felsökning och diskuterar fördelar och begränsningar i förhållande till andra system, och i synnerhet ett uppdaterat och optimerat WorMotel-protokoll15.
Varje enkelmaskodlingsmiljö består av en mikrobricka monterad inuti ett standardfack med en brunn med en anpassad 3D-tryckt adapter (figur 1A). Brunnarna är fyllda med lågsmält agarosnematodtillväxtmedia (lmNGM), sådd med koncentrerade bakterier som näringskälla och omgiven av en palmitinsyrabeläggning för att förhindra att maskar flyr (figur 1B). Utrymmet mellan mikrobrickan och väggarna på enkelbrunnsplattan är fylld med mättade vattenkristaller för att bibehålla fuktigheten (figur 1B). En tvättmedelsbeläggning appliceras på bricklocket för att förhindra kondens. En enda mask läggs till varje brunn, och enkelbrunnsbrickan är förseglad med Parafilm för att bibehålla fukt och tillåta syreutbyte. Upp till sex mikrobrickor kan rimligen förberedas parallellt av en enda praktiserad forskare.
Här beskriver vi ett nytt odlingssystem som anpassar mikrobrickor, ursprungligen utvecklade för humana leukocytantigenvävnadstypningsanalyser, för att möjliggöra isolering och karakterisering av enstaka C. elegans över tid i en fast mediemiljö som kontextuellt liknar den agarbaserade NGM som är standarden i C. elegans forskning. Detta system är kompatibelt med en mängd olika ingrepp, inklusive kostbegränsning, exogen läkemedelsbehandling, en utmaning med kemiska eller miljömässiga stress…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH R35GM133588 till G.L.S., ett NIHT32GM008659 utbildningsbidrag till L.E., ett United States National Academy of Medicine Catalyst Award till G.L.S. och State of Arizona Technology and Research Initiative Fund som administreras av Arizona Board of Regents.
3D-printed terasaki inserts | Custom printing company | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL |
FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament |
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood | Fisher Scientific | 36-100-4376 | |
Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
Carbenicillin | Goldbio | C-103-25 | |
Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
Hydrating water crystals | M2 Polymer Technologies | Type S | Type S super absorbent polymer |
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
Leica K5 sCMOS monochrome camera | Leica Microsystems | 11547112 | |
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope | Leica Microsystems | 10450826 | |
Low-melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
NaCl | Fisher bioreagents | BP358-1 | |
Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Scientific | 264728 | |
Nystatin | Sigma | N1538 | |
Palmitic acid | Acros organics | 129700010 | |
Paper towels | Coastwide Professional | 365374 | |
Parafilm M | Parafilm | 16-101 | |
Stratagene UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075 | UV crosslinker |
Terasaki trays (Lambda) | One Lambda | 151431 | |
Thermolyne Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
Tween | Thermo Scientific | J20605-AP |