Långtidsodling av enskilda Caenorhabditis elegans på fasta medier för longitudinell fluorescensövervakning och aversiva interventioner

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att odla isolerade enskilda nematoder på fasta medier för livslång fysiologisk parameterspårning och fluorescenskvantifiering. Detta odlingssystem inkluderar en palmitinsyrabarriär runt enmaskbrunnar för att förhindra att djur flyr, vilket möjliggör användning av aversiva ingrepp, inklusive patogena bakterier och kemiska stressfaktorer.

Abstract

Caenorhabditis elegans används ofta för att studera åldrande biologi. Standardpraxis i C. elegans åldringsstudier är att odla grupper av maskar på fasta nematodtillväxtmedier (NGM), vilket möjliggör effektiv insamling av data på populationsnivå för överlevnad och andra fysiologiska fenotyper, och periodisk provtagning av subpopulationer för fluorescerande biomarkörkvantifiering. Begränsningar för detta tillvägagångssätt är oförmågan att (1) följa enskilda maskar över tid för att utveckla åldersbanor för fenotyper av intresse och (2) övervaka fluorescerande biomarkörer direkt i samband med odlingsmiljön. Alternativa odlingsmetoder använder flytande kultur eller mikrofluidik för att övervaka enskilda djur över tid, i vissa fall inklusive fluorescenskvantifiering, med avvägningen att odlingsmiljön är kontextuellt skild från fast NGM. WorMotel är en tidigare beskriven mikrofabricerad flerbrunnsanordning för odling av isolerade maskar på fast NGM. Varje mask hålls i en brunn innehållande fast NGM omgiven av en vallgrav fylld med kopparsulfat, ett kontaktavvisande medel för C. elegans, vilket möjliggör longitudinell övervakning av enskilda djur. Vi finner kopparsulfat otillräckligt för att förhindra maskar från att fly när de utsätts för aversiva ingrepp som är vanliga i åldrande forskning, inklusive kostbegränsning, patogena bakterier och kemiska medel som inducerar cellulär stress. Multibrunnsanordningarna är också gjutna av polydimetylsiloxan, vilket ger höga bakgrundsartefakter vid fluorescensavbildning. Detta protokoll beskriver ett nytt tillvägagångssätt för odling av isolerade rundmaskar på fast NGM med kommersiellt tillgängliga polystyrenmikrobrickor, ursprungligen utformade för humant leukocytantigen (HLA) typning, vilket möjliggör mätning av överlevnad, fysiologiska fenotyper och fluorescens över livslängden. En palmitinsyrabarriär hindrar maskar från att fly, även i närvaro av aversiva förhållanden. Varje platta kan odla upp till 96 djur och anpassar sig enkelt till en mängd olika förhållanden, inklusive kostbegränsning, RNAi och kemiska tillsatser, och är kompatibel med automatiserade system för insamling av livslängds- och aktivitetsdata.

Introduction

C. elegans är en kraftfull modellorganism för forskning inom genetik, cellbiologi och molekylärbiologi, eftersom de lätt odlas i laboratoriet, har en kort generationstid och livslängd, delar en hög grad av proteinhomologi med däggdjur och har en transparent kroppsstruktur som möjliggör in vivo-visualisering av fluorescerande proteiner och färgämnen¹. Som ett resultat av den långvariga användningen av C. elegans som ett viktigt modellsystem inom en rad områden, inklusive utvecklingsbiologi och åldrande, är deras tillväxt och utveckling väl förstådd, deras genom har sekvenserats fullständigt och en mängd kraftfulla genetiska verktyg har skapats, inklusive genomomfattande RNAi-matningsbibliotek och tusentals mutanta och transgena stammar. Historiskt odlas C. elegans som populationer på tillväxtmedier för fast agarnematod (NGM), och fenotyper utvärderas manuellt antingen genom direkt observation eller genom avbildning och nedströmsanalys. Fluorescerande mikroskopi används för att fånga en mängd olika molekylära fenotyper med färgämnen eller transgent uttryckta fluorescerande taggar i enskilda C. elegans. Fluorescerande avbildning innebär vanligtvis att fixera eller förlama ett djur på objektglas som innehåller tunna agaroskuddar, vilket är invasivt och ofta dödligt. Det innebär också användning av kemikalier, såsom levamisol eller natriumazid, som potentiellt kan störa den molekylära processen av intresse ^2,3. Tillsammans tillåter dessa tillvägagångssätt tvärsnittsdata på populationsnivå som ska samlas in över ett brett spektrum av fenotyper, men tillåter inte spårning av enskilda djur över tid.

Under de senaste åren har flera metoder uppstått för att odla isolerade C. elegans, vilket gör det möjligt för forskare att fånga dynamiska förändringar i fysiologiska och molekylära fenotyper av djur över tid med hjälp av ny bildteknik. En kategori av C. elegans kulturmetod är mikrofluidikanordningar, inklusive WormFarm⁴, Nemalife-chipet⁵ och “beteende” -chipet av Chronis et ^al.6, bland olika andra ^7,8,9. Relaterade till dessa är vätskebaserade odlingsmetoder, som använder flerbrunnsplattor för att karakterisera enskilda maskar eller små populationer över tiden^10,11. Mikrofluidik och mikroplattsystem ger utmärkta kvantitativa mätningar av fenotypiska svar i C. elegans ner till ett enda djur, men odlingsmiljön utgör en viktig begränsning. Den stora majoriteten av tidigare forskning inom C. elegans, särskilt inom åldrande, har slutförts på fasta agarbaserade medier. Flytande kultur får C. elegans att simma kontinuerligt och representerar ett distinkt miljösammanhang som kan förändra den underliggande biologin. Till exempel har djur som odlats i flytande media drastiskt förändrat fettinnehåll och genuttryck – särskilt för gener som är involverade i stressresponsen – i förhållande till djur som odlas på agarbaserad fast NGM^12,13. En alternativ kategori av avbildningsmetoder för enstaka djur innefattar polydimetylsiloxan (PDMS) -anordningar som isolerar enskilda djur på fasta medier, i ett försök att närmare efterlikna standardmiljön som upplevs av maskar odlade på fast NGM i gruppkultur på Petri-plattor. WorMotel är en 240-brunns PDMS-enhet utformad för att odla enskilda djur på fasta medier. Varje brunn fylls med en modifierad NGM med lågsmält agaros i stället för agar och sås med bakteriell mat, vilket skapar en fast mediemiljö som liknar det vanligaste odlingssystemet med Petri-plattor. Brunnsväggarna är runda, vilket gör att varje djur kan avbildas oavsett plats i brunnen (undvik den visuella skymningen orsakad av ett djur nära en vägg i en flerbrunnsplatta). Kopparsulfat i en smal vallgrav som omger varje brunn används som avskräckande medel för att hålla djur i sina brunnar^14,15. En begränsning av detta tillvägagångssätt är att kopparsulfatet är ineffektivt för att förhindra maskar från att fly när aversiva miljöförhållanden är närvarande, inklusive kostbegränsning, patogena bakterier eller kemikalier som inducerar cellulär stress (t.ex. parakvat).

Ett andra system som använder fasta medier är Worm Corral, som använder en hydrogel för att skapa en liten förseglad miljö för varje mask på ett objektglas, vilket möjliggör långsiktig övervakning av individuellt isolerade djur¹⁶. En viktig begränsning är att djur måste förseglas i miljön som ägg, vilket kräver användning av sterila djur för att förhindra reproduktion och begränsar läkemedelsbehandlingar till en enda applikation. Läkemedelsprövningar med flera doser kan utföras i WorMotel antingen genom att utföra flera exponeringsomgångar innan maskar överförs till enheten eller genom att lokalt tillsätta ytterligare läkemedel till brunnarna under experimentet. I det senare fallet är emellertid den faktiska exponeringsdosen efter tillsats av ytterligare ett läkemedel till en befintlig brunn svår att exakt kvantifiera och beror på hur snabbt läkemedlet bryts ned. Både WorMotel och Worm Corral är utmärkta för ljusfälts- eller mörkfältsavbildning för att fånga information relaterad till aktivitet och djurfysiologi (t.ex. tillväxt och utveckling). Även om dessa system kan användas för att övervaka fluorescens, är PDMS som används för att skapa andra enkelmaskavbildningstekniker enligt vår erfarenhet benägna att bilda mikrobubblor, fånga partiklar och andra små avvikelser som genererar oregelbundna fluorescerande artefakter som stör konsekvent fluorescensvisualisering och kvantifiering, särskilt i emissionsområdet för GFP, den vanligaste fluoroforen som används i C. elegans forskning. Hittills är levande fluorescensavbildning av C. elegans enskilda djur på ett longitudinellt sätt främst beroende av mikrofluidikanordningar¹⁷.

Här beskriver vi en ny metod för odling av enskilda C. elegans på fasta medier som är kompatibel med både aversiva interventioner och direkt fluorescerande avbildning. Detta tillvägagångssätt liknar konceptet för andra avbildningstekniker med en mask, förutom att det specialgjutna PDMS-chipet ersätts med kommersiellt tillgängliga mikrobrickor av polystyren som ursprungligen utvecklades för mikrocytotoxicitetsanalyser (även vanligen kallade Terasaki-brickor)¹⁸. Dessa mikrobrickor har brunnar som kan fyllas med fasta medier och sås med bakteriell mat, vilket nära efterliknar miljön som upplevs av djur under standard fast NGM-odlingsmetodik. Varje brunn är omgiven av en aversiv barriär av palmitinsyra snarare än kopparsulfat. Palmitinsyra används ofta för att förhindra maskar från att fly från fasta medier, med hjälp av standardgruppkultur på Petri-plattor i experiment där maskar utmanas med en aversiv miljö som kostbegränsning eller exponering för en kemisk stressor. Mikrobrickorna producerar också minimal och konsekvent fluorescerande bakgrund, vilket möjliggör fluorescerande avbildning av djur direkt i deras odlingsmiljö. Detta nya solida agarbaserade odlingssystem för ett djur gör det inte bara möjligt att spåra enskilda djur under hela livet och övervaka tillväxt, utveckling, aktivitet och livslängd, utan är också kompatibelt med direkt fluorescerande mikroskopi. Eftersom maskarna kan avbildas utan förlamning eller fixering kan fluorescensbiomarkörer in vivo kvantifieras longitudinellt hos enskilda djur som finns kvar på deras odlingssubstrat, vilket möjliggör observation av dynamiska förändringar under varje djurs livstid. Detta odlingssystem är också kompatibelt med nuvarande generationens automatiserade system för spårning av livslängd och andra hälsomått^14,19. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för odling av enskilda C. elegans i detta mikrobrickbaserade system, diskuterar potentiella fallgropar och felsökning och diskuterar fördelar och begränsningar i förhållande till andra system, och i synnerhet ett uppdaterat och optimerat WorMotel-protokoll¹⁵.

Varje enkelmaskodlingsmiljö består av en mikrobricka monterad inuti ett standardfack med en brunn med en anpassad 3D-tryckt adapter (figur 1A). Brunnarna är fyllda med lågsmält agarosnematodtillväxtmedia (lmNGM), sådd med koncentrerade bakterier som näringskälla och omgiven av en palmitinsyrabeläggning för att förhindra att maskar flyr (figur 1B). Utrymmet mellan mikrobrickan och väggarna på enkelbrunnsplattan är fylld med mättade vattenkristaller för att bibehålla fuktigheten (figur 1B). En tvättmedelsbeläggning appliceras på bricklocket för att förhindra kondens. En enda mask läggs till varje brunn, och enkelbrunnsbrickan är förseglad med Parafilm för att bibehålla fukt och tillåta syreutbyte. Upp till sex mikrobrickor kan rimligen förberedas parallellt av en enda praktiserad forskare.

Protocol

1. Recept OBS: Förbered stamlösningar innan du börjar förbereda mikrobrickplattan. Stamlösningar för tillväxtmedier för agarosnematod med låg smälthalt (lmNGM)Bered 1 MK2 HPO4 genom att lösa 174,18 g K2HPO4 i 1 liter sterilt avjoniserat vatten i en 1 L flaska. Autoklavera lösningen vid 121 °C, 15 psi, i 30 minuter och förvara den i rumstemperatur (RT). Bered 1 M KP i (pH 6,0) genom att lösa 136,09 g K…

Representative Results

Den mikrobrickbaserade enmaskodlingsmiljön som beskrivs här kan användas för att övervaka en mängd olika fenotyper, inklusive livslängd och hälsospan, aktivitet och rörelse, kroppsform och krypgeometri och uttrycket av transgent uttryckta fluorescerande biomarkörer hos enskilda djur över tid. Mikrobrickodlingssystemet är kompatibelt med livslängdsanalys genom antingen manuell poängsättning eller bildinsamling och nedströms bildanalys. Som med standardkultur på Petri-plattor21 kan …

Discussion

Här beskriver vi ett nytt odlingssystem som anpassar mikrobrickor, ursprungligen utvecklade för humana leukocytantigenvävnadstypningsanalyser, för att möjliggöra isolering och karakterisering av enstaka C. elegans över tid i en fast mediemiljö som kontextuellt liknar den agarbaserade NGM som är standarden i C. elegans forskning. Detta system är kompatibelt med en mängd olika ingrepp, inklusive kostbegränsning, exogen läkemedelsbehandling, en utmaning med kemiska eller miljömässiga stress…

Materials

3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP