JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Препарат одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для секвенирования одноклеточных клеток

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64688
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea,Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery,Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science,Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine,Suez Canal University

Summary

Здесь мы демонстрируем приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника тилапии для одноклеточного секвенирования.

Abstract

Нильская тилапия является одним из наиболее часто культивируемых видов пресноводных рыб во всем мире и является широко используемой исследовательской моделью для изучения аквакультуры рыб. Приготовление высококачественных одноклеточных суспензий имеет важное значение для исследований на уровне одной клетки, таких как одноклеточная РНК или секвенирование генома. Тем не менее, не существует готового к использованию протокола для видов рыб аквакультуры, особенно для кишечника тилапии. Эффективные ферменты диссоциации варьируются в зависимости от типа ткани. Поэтому оптимизация протокола диссоциации тканей путем выбора соответствующего фермента или комбинации ферментов для получения достаточного количества жизнеспособных клеток с минимальным повреждением имеет важное значение. Это исследование иллюстрирует оптимизированный протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии с комбинацией ферментов коллагеназы / диспазы. Эта комбинация очень эффективна для диссоциации с использованием бычьего сывороточного альбумина и ДНКазы для уменьшения агрегации клеток после пищеварения. Клеточный выход удовлетворяет требованиям к секвенированию отдельных клеток, с 90% жизнеспособностью клеток и высокой концентрацией клеток. Этот протокол также может быть модифицирован для приготовления одноклеточной суспензии из кишечника других видов рыб. Это исследование обеспечивает эффективный эталонный протокол и снижает потребность в дополнительных испытаниях при приготовлении одноклеточных суспензий для видов рыб аквакультуры.

Introduction

Клетки являются фундаментальными единицами организмов. По сравнению с исследованиями объемных тканей, исследования на уровне отдельных клеток могут отражать гетерогенность клеток и предоставлять информацию с более высоким разрешением1. В последние годы исследователи применили технологии секвенирования отдельных клеток для геномных, транскриптомных, эпигеномных или мультиомных исследований на уровне отдельных клеток у млекопитающих, рыбок данио-рерио и других модельных организмов и сообщили о больших прорывах 2,3,4,5,6,7 . В то время как большинство исследований было сосредоточено на модельных организмах, существует несколько справочных протоколов или коммерческих наборов для диссоциации для секвенирования отдельных клеток у хозяйственных видов рыб, что ограничивает применение секвенирования отдельных клеток в исследованиях аквакультуры. Поэтому разработка протоколов диссоциации тканей, которые производят высококачественные одноклеточные суспензии с высокой жизнеспособностью клеток и целостностью нуклеиновых кислот, имеет решающее значение.

Оптимизация протокола диссоциации тканей с помощью соответствующего фермента или комбинации ферментов для получения достаточного количества жизнеспособных клеток с минимальным повреждением имеет важное значение. Наиболее эффективный фермент для диссоциации тканей варьируется в зависимости от типа ткани. У млекопитающих для приготовления одноклеточных суспензий твердых тканей млекопитающих использовалось несколько ферментов, включая коллагеназу, диспазу, трипсин, папаин, эластазу, гиалуронидазу, либеразу, аккутазу и трипЛЕ 8,9. Переваривание трипсина в сочетании с механическим нарушением обычно используется для диссоциации тканей для культивирования клеток у рыб 10,11,12,13,14. Трипсин также использовался или добавлялся в коктейль пищеварения для диссоциации тканей в кишечнике15 крыс и жаберной ткани16 рыбок данио. Однако по ряду причин трипсин не является лучшим вариантом для секвенирования отдельных клеток. Трипсин сам по себе обычно неэффективен для диссоциации тканей. Кроме того, трипсин индуцирует разрывы цепи ДНК 17,18 и деградацию РНК19.

Папаин разлагает белки, из которых состоят плотные соединения между клетками. В нервных и гладких мышечных клетках млекопитающих папаин более эффективен и менее разрушителен, чем другие протеазы20,21. Однако, как и трипсин, папаин приводит к свободной ДНК-индуцированной агрегации клеток из-за лизиса клеток, который происходит во время ферментативного пищеварения9. Эластаза расщепляет эластин, который обычно содержится в коже, легких, связках, сухожилиях и сосудистых тканях22. Он часто используется в сочетании с коллагеназой, диспазой или трипсином для диссоциации легочной ткани8. Гиалуронидаза расщепляет гликозидные связи гиалуронана, способствуя перевариванию внеклеточного матрикса в различных соединительных тканях и коже 9,23.

В целом, коллагеназа и диспаза являются хорошими вариантами для разрушения внеклеточного матрикса. Они использовались при диссоциации кишечника человека, мышей и рыбок данио-рерио24,25,26,27. Коллагеназа разрушает пептидную связь в коллагене, способствует перевариванию внеклеточного матрикса и высвобождает клетки в суспензию, и, таким образом, коллагеназа часто используется для диссоциации твердых тканей человека и мыши, в том числе для печени 28,29, селезенки30, поджелудочной железы31 и кишечника 25. Диспаза представляет собой протеазу, которая гидролизует N-концевые пептидные связи неполярных аминокислотных остатков и мягче, чем коллагеназа. Он расщепляет компоненты внеклеточного матрикса, такие как фибронектин, коллаген IV типа и, в меньшей степени, коллаген I типа, не влияя на межклеточные соединения. Диспаза используется отдельно или с другими ферментами для диссоциации тканей, таких как кишечник25,32, мозг33, печень 34 и т. Д. Кроме того, коммерчески доступные коктейли для пищеварения, включая либеразу, аккутазу и trypLE, также являются хорошей альтернативой диссоциации твердых тканей, особенно для кожи, печени и почек 8,9.

Нильская тилапия (Oreochromis niloticus) относится к семейству цихловых отряда окунеобразных. Это один из самых культивируемых видов пресноводных рыб в тропических и субтропических районах с годовым производством 4,5 миллиона тонн в 2022 году35. Это один из наиболее изученных видов рыб аквакультуры с хорошо аннотированным геномом. Нильская тилапия является идеальной исследовательской моделью для видов рыб аквакультуры из-за ее короткого времени генерации, простоты выращивания и приспособляемости к широкому спектру условий выращивания. Кишечник представляет большой исследовательский интерес, так как является органом питания, пищеварения и всасывания, обмена веществ и иммунитета слизистой оболочки. Кишечник является средой обитания микробных популяций и является важной иммунной тканью36. Он иммунологически активен благодаря наличию многочисленных типов иммунных клеток, включая макрофаги, В-клетки, гранулоциты и Т-клетки.

В текущем исследовании мы разработали протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для облегчения исследований на уровне отдельных клеток у видов рыб аквакультуры. В соответствии с характеристиками этих тканеспецифических ферментов и предварительной работой, коллагеназа / диспаза подходит для диссоциации ткани кишечника тилапии. Последним типом фермента, который следует учитывать при приготовлении одноклеточных суспензий, является ДНКаза-I, которая предотвращает агрегацию клеток путем разложения свободной ДНК, высвобождаемой в результате лизиса мертвых клеток во время ферментативного переваривания, без инициирования апоптотических путей9 и увеличивает выход живых клеток36. Кроме того, бычий сывороточный альбумин (BSA) добавляется в буфер для промывки, чтобы уменьшить слипание клеток и улучшить жизнеспособность клеток. Несколько компаний-производителей реагентов описывают BSA как стабилизатор ферментов. Добавление 0,04%-1% BSA к PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор) было использовано для разработки промывочного раствора для приготовления суспензий одноклеточного секвенирования без побочных эффектов38. Добавление низкого соотношения BSA может помочь сохранить жизнеспособность клеток и избежать свободной ДНК-индуцированной агрегации клеток из-за лизиса клеток. Этот протокол также может служить ценным справочным материалом для разработки протоколов диссоциации клеток из кишечника других видов рыб аквакультуры.

Protocol

Все протоколы на животных во время этого исследования были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Хайнаньского университета (номер протокола: HNUAUCC-2022-00063; Дата утверждения: 2022-03-03). Список оборудования и расходных материалов, использованных в этом эксперименте, можн?…

Representative Results

В этом протоколе описывается приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника нильской тилапии для одноклеточного секвенирования (рис. 1). Это исследование показывает, что смесь коллагеназы и диспазы обладает хорошим диссоциативным эффектом и мягк?…

Discussion

В этом протоколе описывается приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника нильской тилапии. Перед диссоциацией необходимо удаление жира и брыжейки из кишечника, особенно для толстоядных рыб с большим количеством жира. Использование шприца вместо жесткого сос?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают благодарность за поддержку со стороны Фонда естественных наук провинции Хайнань Китая (No 320QN211) и Программы исследовательского фонда ключевой лаборатории провинции Гуандун по борьбе с болезнями водных животных и здоровой культуре Китая (NO. PBEA2021ZD01).

Materials

0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
  2. He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
  3. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  4. Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
  5. Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
  6. Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
  7. Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
  9. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
  10. Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
  11. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  12. Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
  13. Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
  14. Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
  15. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  16. Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
  17. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
  18. Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
  19. Vrtačnik, P., Kos, &. #. 3. 5. 2. ;., Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
  20. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  21. Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn’s colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
  22. Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
  23. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  24. Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
  25. Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
  26. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
  27. Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
  28. Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
  29. Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
  30. Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
  31. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  32. Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  33. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
  34. Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
  35. FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , (2022).
  36. Beck, B. H., Peatman, E. . Mucosal Health in Aquaculture. , (2015).
  37. Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
  38. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
  39. Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
  40. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  41. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  42. Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
  43. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).

Tags

Single-cell SuspensionNile TilapiaIntestineSingle-cell SequencingEnzymatic Cell DissociationCollagenase DispasePBSFBSIntestinal ContentsMucusBSA-DPBSRNA InhibitorCell Strainer
check_url/pt/64688?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Wang, P., Zhou, Y., Wang, B., Elaswad, A., Wang, S., Guo, W., Zhang, D. Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (192), e64688, doi:10.3791/64688 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image