Здесь мы демонстрируем приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника тилапии для одноклеточного секвенирования.
Нильская тилапия является одним из наиболее часто культивируемых видов пресноводных рыб во всем мире и является широко используемой исследовательской моделью для изучения аквакультуры рыб. Приготовление высококачественных одноклеточных суспензий имеет важное значение для исследований на уровне одной клетки, таких как одноклеточная РНК или секвенирование генома. Тем не менее, не существует готового к использованию протокола для видов рыб аквакультуры, особенно для кишечника тилапии. Эффективные ферменты диссоциации варьируются в зависимости от типа ткани. Поэтому оптимизация протокола диссоциации тканей путем выбора соответствующего фермента или комбинации ферментов для получения достаточного количества жизнеспособных клеток с минимальным повреждением имеет важное значение. Это исследование иллюстрирует оптимизированный протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии с комбинацией ферментов коллагеназы / диспазы. Эта комбинация очень эффективна для диссоциации с использованием бычьего сывороточного альбумина и ДНКазы для уменьшения агрегации клеток после пищеварения. Клеточный выход удовлетворяет требованиям к секвенированию отдельных клеток, с 90% жизнеспособностью клеток и высокой концентрацией клеток. Этот протокол также может быть модифицирован для приготовления одноклеточной суспензии из кишечника других видов рыб. Это исследование обеспечивает эффективный эталонный протокол и снижает потребность в дополнительных испытаниях при приготовлении одноклеточных суспензий для видов рыб аквакультуры.
Клетки являются фундаментальными единицами организмов. По сравнению с исследованиями объемных тканей, исследования на уровне отдельных клеток могут отражать гетерогенность клеток и предоставлять информацию с более высоким разрешением1. В последние годы исследователи применили технологии секвенирования отдельных клеток для геномных, транскриптомных, эпигеномных или мультиомных исследований на уровне отдельных клеток у млекопитающих, рыбок данио-рерио и других модельных организмов и сообщили о больших прорывах 2,3,4,5,6,7 . В то время как большинство исследований было сосредоточено на модельных организмах, существует несколько справочных протоколов или коммерческих наборов для диссоциации для секвенирования отдельных клеток у хозяйственных видов рыб, что ограничивает применение секвенирования отдельных клеток в исследованиях аквакультуры. Поэтому разработка протоколов диссоциации тканей, которые производят высококачественные одноклеточные суспензии с высокой жизнеспособностью клеток и целостностью нуклеиновых кислот, имеет решающее значение.
Оптимизация протокола диссоциации тканей с помощью соответствующего фермента или комбинации ферментов для получения достаточного количества жизнеспособных клеток с минимальным повреждением имеет важное значение. Наиболее эффективный фермент для диссоциации тканей варьируется в зависимости от типа ткани. У млекопитающих для приготовления одноклеточных суспензий твердых тканей млекопитающих использовалось несколько ферментов, включая коллагеназу, диспазу, трипсин, папаин, эластазу, гиалуронидазу, либеразу, аккутазу и трипЛЕ 8,9. Переваривание трипсина в сочетании с механическим нарушением обычно используется для диссоциации тканей для культивирования клеток у рыб 10,11,12,13,14. Трипсин также использовался или добавлялся в коктейль пищеварения для диссоциации тканей в кишечнике15 крыс и жаберной ткани16 рыбок данио. Однако по ряду причин трипсин не является лучшим вариантом для секвенирования отдельных клеток. Трипсин сам по себе обычно неэффективен для диссоциации тканей. Кроме того, трипсин индуцирует разрывы цепи ДНК 17,18 и деградацию РНК19.
Папаин разлагает белки, из которых состоят плотные соединения между клетками. В нервных и гладких мышечных клетках млекопитающих папаин более эффективен и менее разрушителен, чем другие протеазы20,21. Однако, как и трипсин, папаин приводит к свободной ДНК-индуцированной агрегации клеток из-за лизиса клеток, который происходит во время ферментативного пищеварения9. Эластаза расщепляет эластин, который обычно содержится в коже, легких, связках, сухожилиях и сосудистых тканях22. Он часто используется в сочетании с коллагеназой, диспазой или трипсином для диссоциации легочной ткани8. Гиалуронидаза расщепляет гликозидные связи гиалуронана, способствуя перевариванию внеклеточного матрикса в различных соединительных тканях и коже 9,23.
В целом, коллагеназа и диспаза являются хорошими вариантами для разрушения внеклеточного матрикса. Они использовались при диссоциации кишечника человека, мышей и рыбок данио-рерио24,25,26,27. Коллагеназа разрушает пептидную связь в коллагене, способствует перевариванию внеклеточного матрикса и высвобождает клетки в суспензию, и, таким образом, коллагеназа часто используется для диссоциации твердых тканей человека и мыши, в том числе для печени 28,29, селезенки30, поджелудочной железы31 и кишечника 25. Диспаза представляет собой протеазу, которая гидролизует N-концевые пептидные связи неполярных аминокислотных остатков и мягче, чем коллагеназа. Он расщепляет компоненты внеклеточного матрикса, такие как фибронектин, коллаген IV типа и, в меньшей степени, коллаген I типа, не влияя на межклеточные соединения. Диспаза используется отдельно или с другими ферментами для диссоциации тканей, таких как кишечник25,32, мозг33, печень 34 и т. Д. Кроме того, коммерчески доступные коктейли для пищеварения, включая либеразу, аккутазу и trypLE, также являются хорошей альтернативой диссоциации твердых тканей, особенно для кожи, печени и почек 8,9.
Нильская тилапия (Oreochromis niloticus) относится к семейству цихловых отряда окунеобразных. Это один из самых культивируемых видов пресноводных рыб в тропических и субтропических районах с годовым производством 4,5 миллиона тонн в 2022 году35. Это один из наиболее изученных видов рыб аквакультуры с хорошо аннотированным геномом. Нильская тилапия является идеальной исследовательской моделью для видов рыб аквакультуры из-за ее короткого времени генерации, простоты выращивания и приспособляемости к широкому спектру условий выращивания. Кишечник представляет большой исследовательский интерес, так как является органом питания, пищеварения и всасывания, обмена веществ и иммунитета слизистой оболочки. Кишечник является средой обитания микробных популяций и является важной иммунной тканью36. Он иммунологически активен благодаря наличию многочисленных типов иммунных клеток, включая макрофаги, В-клетки, гранулоциты и Т-клетки.
В текущем исследовании мы разработали протокол приготовления высококачественной одноклеточной суспензии из кишечника нильской тилапии для облегчения исследований на уровне отдельных клеток у видов рыб аквакультуры. В соответствии с характеристиками этих тканеспецифических ферментов и предварительной работой, коллагеназа / диспаза подходит для диссоциации ткани кишечника тилапии. Последним типом фермента, который следует учитывать при приготовлении одноклеточных суспензий, является ДНКаза-I, которая предотвращает агрегацию клеток путем разложения свободной ДНК, высвобождаемой в результате лизиса мертвых клеток во время ферментативного переваривания, без инициирования апоптотических путей9 и увеличивает выход живых клеток36. Кроме того, бычий сывороточный альбумин (BSA) добавляется в буфер для промывки, чтобы уменьшить слипание клеток и улучшить жизнеспособность клеток. Несколько компаний-производителей реагентов описывают BSA как стабилизатор ферментов. Добавление 0,04%-1% BSA к PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор) было использовано для разработки промывочного раствора для приготовления суспензий одноклеточного секвенирования без побочных эффектов38. Добавление низкого соотношения BSA может помочь сохранить жизнеспособность клеток и избежать свободной ДНК-индуцированной агрегации клеток из-за лизиса клеток. Этот протокол также может служить ценным справочным материалом для разработки протоколов диссоциации клеток из кишечника других видов рыб аквакультуры.
В этом протоколе описывается приготовление высококачественной одноклеточной суспензии кишечника нильской тилапии. Перед диссоциацией необходимо удаление жира и брыжейки из кишечника, особенно для толстоядных рыб с большим количеством жира. Использование шприца вместо жесткого сос?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность за поддержку со стороны Фонда естественных наук провинции Хайнань Китая (No 320QN211) и Программы исследовательского фонда ключевой лаборатории провинции Гуандун по борьбе с болезнями водных животных и здоровой культуре Китая (NO. PBEA2021ZD01).
0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C. |
Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |