Hier demonstrieren wir die Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus Tilapia-Darm für die Einzelzell-Sequenzierung.
Nil-Tilapia ist eine der am häufigsten kultivierten Süßwasserfischarten weltweit und ein weit verbreitetes Forschungsmodell für Aquakulturfischstudien. Die Herstellung von qualitativ hochwertigen Einzelzellsuspensionen ist für Einzelzellstudien wie Einzelzell-RNA oder Genomsequenzierung unerlässlich. Es gibt jedoch kein gebrauchsfertiges Protokoll für Aquakulturfischarten, insbesondere für den Darm von Tilapia. Die wirksamen Dissoziationsenzyme variieren je nach Gewebetyp. Daher ist es wichtig, das Gewebedissoziationsprotokoll durch die Auswahl des geeigneten Enzyms oder der Enzymkombination zu optimieren, um genügend lebensfähige Zellen mit minimaler Schädigung zu erhalten. Diese Studie veranschaulicht ein optimiertes Protokoll zur Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus Nil-Tilapia-Darm mit einer Enzymkombination aus Kollagenase/Dispase. Diese Kombination ist hochwirksam für die Dissoziation mit der Verwendung von Rinderserumalbumin und DNase, um die Zellaggregation nach der Verdauung zu reduzieren. Der Zellausstoß erfüllt die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung mit einer Zellviabilität von 90 % und einer hohen Zellkonzentration. Dieses Protokoll kann auch modifiziert werden, um eine einzellige Suspension aus dem Darm anderer Fischarten herzustellen. Diese Forschung stellt ein effizientes Referenzprotokoll dar und reduziert den Bedarf an zusätzlichen Versuchen bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Aquakulturfischarten.
Zellen sind die Grundbausteine von Organismen. Im Vergleich zu Bulk-Gewebestudien können Studien auf Einzelzellebene die Zellheterogenität widerspiegeln und Informationen mit höherer Auflösung liefern1. In den letzten Jahren haben Forscher Einzelzellsequenzierungstechnologien für Genom-, Transkriptom-, Epigenom- oder Multi-Omik-Studien auf Einzelzellebene bei Säugetieren, Zebrafischen und anderenModellorganismen angewendet und von großen Durchbrüchen berichtet 2,3,4,5,6,7 . Während sich die meisten Studien auf Modellorganismen konzentriert haben, gibt es nur wenige Referenzprotokolle oder kommerzielle Dissoziationskits für die Einzelzellsequenzierung bei wirtschaftlichen Fischarten, was die Anwendung der Einzelzellsequenzierung in der Aquakulturforschung einschränkt. Daher ist die Entwicklung von Gewebedissoziationsprotokollen, die qualitativ hochwertige Einzelzellsuspensionen mit hoher Zellviabilität und Nukleinsäureintegrität herstellen, von entscheidender Bedeutung.
Die Optimierung des Gewebedissoziationsprotokolls mit dem geeigneten Enzym oder der Enzymkombination ist von entscheidender Bedeutung, um genügend lebensfähige Zellen mit minimaler Schädigung zu erhalten. Welches Enzym für die Gewebedissoziation am effektivsten ist, hängt vom Gewebetyp ab. Bei Säugetieren wurden mehrere Enzyme zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen für festes Gewebe von Säugetieren verwendet, darunter Kollagenase, Dispase, Trypsin, Papain, Elastase, Hyaluronidase, Liberase, Accutase und TrypLE 8,9. Die Trypsinverdauung in Kombination mit mechanischer Störung wurde häufig verwendet, um Gewebe für die Zellkultur bei Fischen zu dissoziieren 10,11,12,13,14. Trypsin wurde auch für die Gewebedissoziation im Rattendarm15 und im Zebrafisch-Kiemengewebe16 verwendet oder dem Verdauungscocktail zugesetzt. Aus mehreren Gründen ist Trypsin jedoch nicht die beste Option für die Einzelzellsequenzierung. Trypsin allein ist bei der Gewebedissoziation in der Regel unwirksam. Zusätzlich induziert Trypsin DNA-Strangbrüche 17,18 und RNA-Abbau19.
Papain baut die Proteine ab, aus denen die Tight Junctions zwischen den Zellen bestehen. In Nervenzellen und glatten Muskelzellen von Säugetieren ist Papain effizienter und weniger zerstörerisch als andere Proteasen20,21. Wie Trypsin führt Papain jedoch zu einer freien DNA-induzierten Aggregation von Zellen aufgrund der Zelllyse, die während der enzymatischen Verdauung stattfindet9. Elastase baut Elastin ab, das typischerweise in Haut, Lunge, Bändern, Sehnen und Gefäßgewebe vorkommt22. Es wird häufig in Kombination mit Kollagenase, Dispase oder Trypsin zur Dissoziation von Lungengewebe verwendet8. Hyaluronidase spaltet die glykosidischen Bindungen der Hyaluronsäure und trägt zur Verdauung der extrazellulären Matrix in verschiedenen Bindegeweben und der Haut bei 9,23.
Im Allgemeinen sind Kollagenase und Dispase gute Optionen für den Abbau der extrazellulären Matrix. Sie wurden bei der Dissoziation von Menschen-, Maus- und Zebrafischdärmenverwendet 24,25,26,27. Kollagenase zerstört die Peptidbindung im Kollagen, fördert die Verdauung der extrazellulären Matrix und setzt die Zellen in Suspension frei, so dass Kollagenase häufig für die Dissoziation von festem Gewebe von Mensch und Maus verwendet wird, einschließlich für die Leber 28,29, Milz30, Bauchspeicheldrüse31 und Darm 25. Dispase ist eine Protease, die die N-terminalen Peptidbindungen unpolarer Aminosäurereste hydrolysiert und milder als Kollagenase ist. Es spaltet die Bestandteile der extrazellulären Matrix, wie Fibronektin, Typ-IV-Kollagen und in geringerem Maße Typ-I-Kollagen, ohne die Zell-Zell-Verbindungen zu beeinträchtigen. Dispase wird separat oder zusammen mit anderen Enzymen zur Gewebedissoziation verwendet, z. B. für Darm25,32, Gehirn 33, Leber 34 usw. Darüber hinaus sind kommerziell erhältliche Verdauungscocktails, einschließlich Liberase, Accutase und TrypLE, auch gute Alternativen für die Dissoziation fester Gewebe, insbesondere für Haut, Leber und Niere 8,9.
Nil-Tilapia (Oreochromis niloticus) gehört zur Familie der Cichlidae aus der Ordnung der Perciformes. Er ist eine der am häufigsten gezüchteten Süßwasserfischarten in tropischen und subtropischen Gebieten mit einer Jahresproduktion von 4,5 Millionen Tonnen im Jahr 202235. Er ist eine der am besten untersuchten Aquakulturfischarten mit einem gut annotierten Genom. Nil-Tilapia ist aufgrund seiner kurzen Generationszeit, seiner einfachen Aufzucht und seiner Anpassungsfähigkeit an eine Vielzahl von Aufzuchtumgebungen ein ideales Forschungsmodell für Aquakulturfischarten. Der Darm ist von großem Forschungsinteresse, da er das Organ der Ernährung, der Verdauung und Resorption, des Stoffwechsels und der Immunität der Schleimhäute ist. Der Darm ist Lebensraum mikrobieller Populationen und ein essentielles Immungewebe36. Es ist immunologisch aktiv, da zahlreiche Immunzelltypen vorhanden sind, darunter Makrophagen, B-Zellen, Granulozyten und T-Zellen.
In der aktuellen Studie haben wir ein Protokoll zur Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus dem Nil-Tilapia-Darm entwickelt, um Einzelzellstudien in Aquakulturfischarten zu ermöglichen. Entsprechend den Eigenschaften dieser gewebespezifischen Enzyme und der Vorarbeiten ist Kollagenase/Dispase geeignet, um Tilapia-Darmgewebe zu dissoziieren. Der letzte Enzymtyp, der bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen zu berücksichtigen ist, ist DNase-I, der die Zellaggregation verhindert, indem er freie DNA abbaut, die durch die Lyse toter Zellen während der enzymatischen Verdauung freigesetzt wird, ohne apoptotische Wege zu initiieren9 , und die Ausbeute an lebenden Zellen erhöht36. Zusätzlich wird dem Waschpuffer Rinderserumalbumin (BSA) zugesetzt, um die Zellverklumpung zu reduzieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Mehrere Reagenzienhersteller beschreiben BSA als Enzymstabilisator. Die Zugabe von 0,04 %-1 % BSA zu PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) wurde verwendet, um eine Waschlösung zur Herstellung von Einzelzell-Sequenzierungssuspensionen ohne nachteilige Auswirkungen zu entwickeln38. Die Zugabe eines niedrigen BSA-Verhältnisses könnte dazu beitragen, die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und die durch freie DNA induzierte Aggregation von Zellen aufgrund der Zelllyse zu vermeiden. Dieses Protokoll kann auch eine wertvolle Referenz für die Entwicklung von Zelldissoziationsprotokollen aus dem Darm anderer Aquakulturfischarten darstellen.
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer hochwertigen einzelligen Suspension aus Nil-Tilapia-Darm. Vor der Dissoziation ist die Entfernung von Fett und Mesenterium aus dem Darm notwendig, insbesondere bei fleischfressenden Fischdärmen mit viel Fett. Die Verwendung einer Spritze anstelle von hartem Schaben zum Abwaschen des Darminhalts reduziert die mechanische Schädigung der Zellen. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten, ist es auch wichtig, die Temperatur für die Gewebedissektion und das Spül…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung durch die Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (Nr. 320QN211) und das Forschungsfondsprogramm des Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (Nr. PBEA2021ZD01).
0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C. |
Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |