Preparação de Suspensão de Célula Única do Intestino de Tilápia do Nilo para Sequenciamento de Célula Única
Summary
Aqui, demonstramos a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia para sequenciamento unicelular.
Abstract
A tilápia-do-nilo é uma das espécies de peixes de água doce mais cultivadas em todo o mundo e é um modelo de pesquisa amplamente utilizado para estudos de peixes de aquicultura. A preparação de suspensões unicelulares de alta qualidade é essencial para estudos em nível de célula única, como RNA de célula única ou sequenciamento genômico. No entanto, não existe um protocolo pronto para uso para espécies de peixes de aquicultura, particularmente para o intestino da tilápia. As enzimas de dissociação efetivas variam dependendo do tipo de tecido. Portanto, otimizar o protocolo de dissociação tecidual selecionando a enzima ou combinação enzimática apropriada para obter células viáveis suficientes com o mínimo de dano é essencial. Este estudo ilustra um protocolo otimizado para preparar uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia do Nilo com uma combinação enzimática de colagenase/dispase. Esta combinação é altamente eficaz para dissociação com a utilização de albumina de soro bovino e DNase para reduzir a agregação celular após a digestão. A produção celular satisfaz os requisitos para sequenciamento unicelular, com 90% de viabilidade celular e alta concentração celular. Este protocolo também pode ser modificado para preparar uma suspensão unicelular do intestino de outras espécies de peixes. Esta pesquisa fornece um protocolo de referência eficiente e reduz a necessidade de ensaios adicionais na preparação de suspensões unicelulares para espécies de peixes de aquicultura.
Introduction
As células são as unidades fundamentais dos organismos. Comparados a estudos de tecidos volumosos, estudos em nível de célula única podem refletir a heterogeneidade celular e fornecer informações de maior resolução1. Nos últimos anos, pesquisadores têm aplicado tecnologias de sequenciamento unicelular para estudos genômicos, transcriptomas, epigenomas ou multi-ômicos em nível unicelular em mamíferos, peixes-zebra e outros organismos modelo e relatado grandes avanços 2,3,4,5,6,7 . Embora a maioria dos estudos tenha se concentrado em organismos-modelo, há poucos protocolos de referência ou kits comerciais de dissociação para sequenciamento unicelular em espécies econômicas de peixes, o que limita a aplicação do sequenciamento unicelular em pesquisas aquícolas. Portanto, o desenvolvimento de protocolos de dissociação tecidual que produzam suspensões unicelulares de alta qualidade com alta viabilidade celular e integridade de ácidos nucleicos é crucial.
A otimização do protocolo de dissociação tecidual com a combinação enzimática ou enzimática apropriada para obter células viáveis suficientes com o mínimo de dano é essencial. A enzima mais eficaz para a dissociação tecidual varia de acordo com o tipo de tecido. Em mamíferos, várias enzimas têm sido utilizadas para preparar suspensões unicelulares para tecidos sólidos de mamíferos, incluindo colagenase, dispase, tripsina, papaína, elastase, hialuronidase, liberase, accutase e tripLE 8,9. A digestão de tripsina combinada com ruptura mecânica tem sido comumente utilizada para dissociar tecidos para cultura celular em peixes 10,11,12,13,14. A tripsina também tem sido usada ou adicionada ao coquetel de digestão para dissociação tecidual no intestino de ratos15 e tecido branquial de peixe-zebra16. No entanto, por várias razões, a tripsina não é a melhor opção para o sequenciamento unicelular. A tripsina isolada é geralmente ineficaz para a dissociação tecidual. Adicionalmente, a tripsina induz quebras de fitas de DNA 17,18 e degradação de RNA19.
A papaína degrada as proteínas que compõem as tight junctions entre as células. Em células nervosas e musculares lisas de mamíferos, a papaína é mais eficiente e menos destrutiva que outras proteases20,21. Entretanto, assim como a tripsina, a papaína resulta na agregação celular induzida pelo DNA livre devido à lise celular que ocorre durante a digestão enzimática9. A elastase decompõe a elastina, que é tipicamente encontrada na pele, pulmões, ligamentos, tendões e tecidos vasculares22. É frequentemente usado em combinação com colagenase, dispase ou tripsina para dissociar o tecido pulmonar8. A hialuronidase cliva as ligações glicosídicas do hialuronano, contribuindo para a digestão da matriz extracelular em vários tecidos conjuntivos e pele 9,23.
Em geral, colagenase e dispase são boas opções para a quebra da matriz extracelular. Eles têm sido utilizados na dissociação dos intestinos de humanos, camundongos e peixes-zebra24,25,26,27. A colagenase destrói a ligação peptídica no colágeno, promove a digestão da matriz extracelular e libera as células em suspensão, e, assim, a colagenase é frequentemente utilizada para dissociação de tecidos sólidos humanos e de camundongos, inclusive para o fígado 28,29, baço30, pâncreas31 e intestino 25. Dispase é uma protease que hidrolisa as ligações peptídicas N-terminais de resíduos de aminoácidos apolares e é mais suave que a colagenase. Cliva os componentes da matriz extracelular, como fibronectina, colágeno tipo IV e, em menor grau, colágeno tipo I, sem afetar as junções célula-célula. Dispase é usado separadamente ou com outras enzimas para dissociação tecidual, como intestino25,32, cérebro33, fígado34, etc. Além disso, coquetéis de digestão comercialmente disponíveis, incluindo liberase, accutase e triple, também são boas alternativas para a dissociação de tecidos sólidos, especialmente para pele, fígado e rins 8,9.
A tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) pertence à família Cichlidae da ordem Perciformes. É uma das espécies de peixes de água doce mais cultivadas em áreas tropicais e subtropicais, com uma produção anual de 4,5 milhões de toneladas em 202235. É uma das espécies de peixes de aquicultura mais bem estudadas com um genoma bem anotado. A tilápia-do-nilo é um modelo de pesquisa ideal para espécies de peixes aquícolas devido ao seu curto tempo de geração, facilidade de criação e adaptabilidade a uma ampla gama de ambientes de criação. O intestino é de grande interesse de pesquisa, pois é o órgão da digestão e absorção da nutrição, metabolismo e imunidade das mucosas. O intestino é o habitat das populações microbianas e é um tecido imune essencial36. É imunologicamente ativo devido à presença de numerosos tipos de células imunes, incluindo macrófagos, células B, granulócitos e células T.
No presente estudo, desenvolvemos um protocolo para preparar uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino da tilápia do Nilo para facilitar estudos em nível unicelular em espécies de peixes de aquicultura. De acordo com as características dessas enzimas tecido-específicas e trabalhos preliminares, a colagenase/dispase é apropriada para dissociar o tecido intestinal da tilápia. O último tipo enzimático a ser considerado no preparo de suspensões unicelulares é a DNase-I, que impede a agregação celular degradando o DNA livre liberado pela lise de células mortas durante a digestão enzimática sem iniciar vias apoptóticas9 e aumenta o rendimento de células vivas36. Além disso, a albumina de soro bovino (BSA) é adicionada ao tampão de lavagem para reduzir a aglomeração celular e melhorar a viabilidade celular. Várias empresas de reagentes descrevem a BSA como um estabilizador enzimático. A adição de BSA 0,04%-1% ao PBS (phosphate-buffered saline) tem sido utilizada para desenvolver uma solução de lavagem para o preparo de suspensões de sequenciamento unicelular sem efeitos adversos38. A adição de uma baixa proporção de BSA poderia ajudar a manter a viabilidade celular e evitar a agregação livre induzida por DNA de células devido à lise celular. Este protocolo também pode fornecer uma referência valiosa para o desenvolvimento de protocolos de dissociação celular do intestino de outras espécies de peixes de aquicultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia do Nilo. Antes da dissociação, a remoção de gordura e mesentério do intestino é necessária, particularmente para intestinos de peixes carnívoros com muita gordura. Usar uma seringa em vez de raspagem dura para lavar o conteúdo intestinal reduz os danos mecânicos às células. Para garantir a viabilidade celular, também é essencial manter a temperatura em 20 °C ou abaixo para as etapas de dissecção…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer o apoio da Fundação Provincial de Ciências Naturais de Hainan da China (NO. 320QN211) e do Programa de Fundo de Pesquisa do Laboratório Chave da Província de Guangdong de Controle de Doenças de Animais Aquáticos e Cultura Saudável da China (NO. PBEA2021ZD01).
Materials
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
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