Preparación de suspensión unicelular del intestino de tilapia del Nilo para secuenciación unicelular
Summary
Aquí, demostramos la preparación de una suspensión unicelular de alta calidad de intestino de tilapia para secuenciación de células individuales.
Abstract
La tilapia del Nilo es una de las especies de peces de agua dulce más comúnmente cultivadas en todo el mundo y es un modelo de investigación ampliamente utilizado para estudios de peces acuícolas. La preparación de suspensiones unicelulares de alta calidad es esencial para estudios a nivel de una sola célula, como el ARN unicelular o la secuenciación del genoma. Sin embargo, no existe un protocolo listo para usar para las especies de peces de acuicultura, particularmente para el intestino de la tilapia. Las enzimas de disociación efectivas varían según el tipo de tejido. Por lo tanto, es esencial optimizar el protocolo de disociación tisular seleccionando la enzima o combinación de enzimas adecuada para obtener suficientes células viables con un daño mínimo. Este estudio ilustra un protocolo optimizado para preparar una suspensión unicelular de alta calidad a partir del intestino de tilapia del Nilo con una combinación enzimática de colagenasa / dispasa. Esta combinación es altamente efectiva para la disociación con la utilización de albúmina sérica bovina y DNasa para reducir la agregación celular después de la digestión. La salida celular satisface los requisitos para la secuenciación de una sola célula, con una viabilidad celular del 90% y una alta concentración celular. Este protocolo también se puede modificar para preparar una suspensión unicelular de los intestinos de otras especies de peces. Esta investigación proporciona un protocolo de referencia eficiente y reduce la necesidad de ensayos adicionales en la preparación de suspensiones unicelulares para especies de peces de acuicultura.
Introduction
Las células son las unidades fundamentales de los organismos. En comparación con los estudios de tejido a granel, los estudios a nivel de una sola célula pueden reflejar la heterogeneidad celular y proporcionar información de mayor resolución1. En los últimos años, los investigadores han aplicado tecnologías de secuenciación de células individuales para estudios de genoma, transcriptoma, epigenoma o multiómicos a nivel de una sola célula en mamíferos, peces cebra y otros organismos modelo y reportaron grandes avances 2,3,4,5,6,7 . Si bien la mayoría de los estudios se han centrado en organismos modelo, existen pocos protocolos de referencia o kits de disociación comercial para la secuenciación de células individuales en especies de peces económicas, lo que limita la aplicación de la secuenciación de células individuales en la investigación acuícola. Por lo tanto, es crucial desarrollar protocolos de disociación tisular que produzcan suspensiones unicelulares de alta calidad con alta viabilidad celular e integridad de ácidos nucleicos.
Optimizar el protocolo de disociación tisular con la enzima o combinación de enzimas adecuada para obtener suficientes células viables con un daño mínimo es esencial. La enzima más eficaz para la disociación tisular varía según el tipo de tejido. En mamíferos, se han utilizado varias enzimas para preparar suspensiones unicelulares para tejidos sólidos de mamíferos, incluyendo colagenasa, dispasa, tripsina, papaína, elastasa, hialuronidasa, liberasa, accutasa y tripLE 8,9. La digestión de tripsina combinada con la interrupción mecánica se ha utilizado comúnmente para disociar tejidos para el cultivo celular en peces 10,11,12,13,14. La tripsina también se ha utilizado o añadido en el cóctel de digestión para la disociación tisular en el intestino de rata15 y el tejido branquial del pez cebra16. Sin embargo, por varias razones, la tripsina no es la mejor opción para la secuenciación de células individuales. La tripsina sola suele ser ineficaz para la disociación tisular. Además, la tripsina induce roturas de la cadena de ADN 17,18 y degradación del ARN19.
La papaína degrada las proteínas que forman las uniones estrechas entre las células. En las células nerviosas y musculares lisas de mamíferos, la papaína es más eficiente y menos destructiva que otras proteasas20,21. Sin embargo, al igual que la tripsina, la papaína resulta en la agregación de células inducida por ADN libre debido a la lisis celular que ocurre durante la digestión enzimática9. La elastasa descompone la elastina, que se encuentra típicamente en la piel, los pulmones, los ligamentos, los tendones y los tejidos vasculares22. A menudo se utiliza en combinación con colagenasa, dispasa o tripsina para disociar el tejido pulmonar8. La hialuronidasa rompe los enlaces glucosídicos del hialuronano, contribuyendo a la digestión de la matriz extracelular en diversos tejidos conectivos y piel 9,23.
En general, la colagenasa y la dispasa son buenas opciones para la ruptura de la matriz extracelular. Se han utilizado en la disociación de intestinos humanos, de ratón y de pez cebra24,25,26,27. La colagenasa destruye el enlace peptídico en el colágeno, promueve la digestión de la matriz extracelular y libera las células en suspensión y, por lo tanto, la colagenasa se usa a menudo para la disociación del tejido sólido humano y de ratón, incluso para el hígado 28,29, bazo30, páncreas31 e intestino 25. La dispasa es una proteasa que hidroliza los enlaces peptídicos N-terminales de los residuos de aminoácidos no polares y es más suave que la colagenasa. Escinde los componentes de la matriz extracelular, como la fibronectina, el colágeno tipo IV y, en menor medida, el colágeno tipo I, sin afectar las uniones célula-célula. La dispasa se usa por separado o con otras enzimas para la disociación de tejidos, como para el intestino25,32, el cerebro33, el hígado34, etc. Además, los cócteles de digestión disponibles comercialmente, incluyendo liberasa, accutasa y trypLE, también son buenas alternativas para la disociación del tejido sólido, especialmente para la piel, el hígado y el riñón 8,9.
La tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) pertenece a la familia Cichlidae del orden Perciformes. Es una de las especies de peces de agua dulce más cultivadas en áreas tropicales y subtropicales, con una producción anual de 4,5 millones de toneladas en 202235. Es una de las especies de peces de acuicultura mejor estudiadas con un genoma bien anotado. La tilapia del Nilo es un modelo de investigación ideal para las especies de peces de acuicultura debido a su corto tiempo de generación, facilidad de cría y adaptabilidad a una amplia gama de entornos de cría. El intestino es de gran interés de investigación, ya que es el órgano de nutrición, digestión y absorción, metabolismo e inmunidad de la mucosa. El intestino es el hábitat de las poblaciones microbianas y es un tejido inmune esencial36. Es inmunológicamente activo debido a la presencia de numerosos tipos de células inmunes, incluyendo macrófagos, células B, granulocitos y células T.
En el estudio actual, desarrollamos un protocolo para preparar una suspensión unicelular de alta calidad del intestino de tilapia del Nilo para facilitar estudios a nivel de una sola célula en especies de peces acuícolas. De acuerdo con las características de estas enzimas específicas del tejido y el trabajo preliminar, la colagenasa/dispasa es apropiada para disociar el tejido intestinal de la tilapia. El último tipo de enzima a considerar en la preparación de suspensiones unicelulares es DNasa-I, que previene la agregación celular al degradar el ADN libre liberado a través de la lisis de células muertas durante la digestión enzimática sin iniciar vías apoptóticas9 y aumenta el rendimiento de células vivas36. Además, la albúmina sérica bovina (BSA) se agrega al tampón de lavado para reducir la aglutinación celular y mejorar la viabilidad celular. Varias compañías de reactivos describen BSA como un estabilizador enzimático. La adición de 0,04%-1% de BSA al PBS (solución salina tamponada con fosfato) se ha utilizado para desarrollar una solución de lavado para la preparación de suspensiones de secuenciación unicelular sin efectos adversos38. La adición de una baja proporción de BSA podría ayudar a mantener la viabilidad celular y evitar la agregación de células inducida por ADN libre debido a la lisis celular. Este protocolo también puede proporcionar una referencia valiosa para desarrollar protocolos de disociación celular de los intestinos de otras especies de peces de acuicultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la preparación de una suspensión unicelular de alta calidad del intestino de tilapia del Nilo. Antes de la disociación, es necesaria la eliminación de grasa y mesenterio del intestino, particularmente para los intestinos de peces carnívoros con mucha grasa. El uso de una jeringa en lugar de raspado duro para lavar el contenido intestinal reduce el daño mecánico a las células. Para garantizar la viabilidad celular, también es esencial mantener la temperatura a 20 °C o menos para los pasos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el apoyo de la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Hainan de China (NO. 320QN211) y el Programa del Fondo de Investigación del Laboratorio Provincial Clave de Control de Enfermedades de Animales Acuáticos y Cultura Saludable de China de Guangdong (NO. PBEA2021ZD01).
Materials
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
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