HPLC accoppiato con impronte digitali chimiche per il riconoscimento multi-pattern per identificare l'autenticità di Clematidis armandii caulis
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per stabilire la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), accoppiata con il riconoscimento multi-pattern delle impronte digitali chimiche, che fornisce una nuova strategia per identificare efficacemente le varietà autentiche di Clematidis Armandii Caulis e dei suoi adulteranti.
Abstract
Un metodo per identificare i materiali medicinali cinesi e i relativi adulteranti è stato costruito prendendo come esempio Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, una medicina tradizionale cinese universalmente usata). Dieci lotti di varietà Chuanmutong autentiche e cinque lotti di adulteranti correlati sono stati analizzati e confrontati sulla base delle impronte digitali della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) combinate con la chemiometria, tra cui l’analisi dei cluster (CA), l’analisi delle componenti principali (PCA) e l’analisi della discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA). Inoltre, è stato determinato il contenuto di β-sitosterolo. È stata stabilita l’impronta chimica di controllo di Chuanmutong e sono stati identificati 12 picchi comuni. La somiglianza tra l’impronta digitale di 10 lotti di varietà Chuanmutong autentiche e l’impronta digitale di controllo era 0,910-0,989, mentre la somiglianza di cinque lotti di adulteranti era solo 0,133-0,720. Sulla base dei picchi comuni nel cromatogramma, 15 lotti di campioni sono stati classificati in tre livelli di contenuto dalla PCA e sono stati aggregati in quattro categorie da CA, ottenendo una chiara distinzione tra Chuanmutong autentico e adulteranti di Chuanmutong. Inoltre, sette componenti differenziali che possono identificare efficacemente l’autentico Chuanmutong e gli adulteranti di Chuanmutong sono stati trovati attraverso OPLS-DA. Il contenuto di β-sitosterolo di 10 lotti di varietà Chuanmutong autentiche era 97,53-161,56 μg / g, mentre il contenuto di β-sitosterolo dei cinque lotti di adulteranti variava notevolmente, tra cui il contenuto di β-sitosterolo di Clematis peterae Hand.-Mazz. e Clematis gouriana Roxb. finetii Rehd. et Wils. era significativamente inferiore a quello delle varietà autentiche di Chuanmutong. Il contenuto dei componenti dell’indice HPLC e il metodo di riconoscimento multi-pattern delle impronte digitali chimiche stabilito in questo studio forniscono una nuova strategia per identificare efficacemente i materiali medicinali cinesi autentici e i relativi adulteranti.
Introduction
Chuanmutong, Caulis secco di Clematis armandii Franch. o Clematis montana Buch.-Ham., è una medicina tradizionale cinese comunemente usata nelle cliniche 1,2,3. È usato per il trattamento di problemi urinari, edema, piaghe sulla lingua e sulla bocca, diminuzione della secrezione di latte, rigidità articolare e dolori muscolari causati dal calore umido4. Chuanmutong è sempre stato ottenuto da varietà selvatiche, distribuite principalmente nel sud-ovest della Cina, in particolare nel Sichuan, dove la migliore qualità può essere trovata 5,6. È difficile distinguere tra varietà autentiche e adulteranti strettamente correlati a causa delle loro caratteristiche simili 7,8,9,10. Lo standard di qualità di Chuanmutong nell’edizione 2020 della Farmacopea cinese stabilisce solo le proprietà, l’identificazione microscopica e l’identificazione dello strato sottile senza determinazione del contenuto, che non possono identificare efficacemente gli adulteranti e quindi hanno potenziali rischi. Inoltre, ci sono pochi rapporti che confrontano e identificano Chuanmutong e piante correlate. Di conseguenza, un metodo di controllo della qualità per garantire l’autenticità di Chuanmutong merita ulteriori studi.
I costituenti chimici di Chuanmutong sono composti principalmente da triterpenoidi pentaciclici di tipo oleanano e dai loro glicosidi, flavonoidi e acidi organici11,12,13,14. Tra questi, l’acido oleanolico, il β-sitosterolo, lo stigmasterolo e l’ergosterolo hanno effetti diuretici di diversa intensità, che possono essere potenziali sostanze farmacodinamiche per promuovere la diuresi e alleviare la stranguria15,16. Le impronte digitali chimiche sono ottenute separando e rilevando molti componenti chimici contenuti nei campioni mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), gascromatografia (GC), ecc. L’adozione di appropriati metodi di analisi statistica per analizzare le caratteristiche di Chuanmutong può determinare il controllo complessivo della qualità e l’identificazione scientifica della medicina tradizionale cinese17,18,19.
In questo studio sono stati raccolti 10 lotti di varietà autentiche Chuanmutong e cinque lotti di adulteranti. La loro qualità è stata confrontata e analizzata con il metodo delle impronte digitali HPLC combinato con il riconoscimento multi-pattern, tra cui l’analisi dei cluster (CA), l’analisi delle componenti principali (PCA), l’analisi della discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-CA) e la determinazione del contenuto della componente farmacodinamica. Questo protocollo stabilisce un metodo per identificare varietà autentiche con elevata specificità, una nuova strategia per l’identificazione scientifica di varietà autentiche e adulteranti di materiali medicinali cinesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La raccolta di campioni per la ricerca è il primo passo chiave per costruire il riconoscimento multi-pattern nell’identificazione dell’autenticità dei materiali medicinali cinesi. Attraverso ricerche di mercato, abbiamo scoperto che Sichuan Ya’an, Liangshan e Leshan sono le principali aree di produzione delle risorse selvatiche di Chuanmutong. Anche le varietà affini dello stesso genere hanno la stessa distribuzione geografica 6,20; CC, DC, DE, XS e SMT sono s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto della Sichuan Traditional Chinese Medicine Administration (n. 2020JC0088, n. 2021MS203).
Materials
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | – | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | – | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | – | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | – | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | – | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
Referências
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