クレマチディス・アルマンディ・カリスの真正性を識別するためのマルチパターン認識のための化学フィンガープリントと組み合わせたHPLC
Summary
ここでは、クレ マチディス・アルマンディ・カウリス とその偽和物の本物の品種を効果的に識別するための新しい戦略を提供する、化学的指紋マルチパターン認識と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を確立するためのプロトコルを提示します。
Abstract
漢方薬とその関連不純物を同定する方法は、 クレマチディス・アルマンディ・カリス (チュアンムトン、普遍的に使用されている伝統的な漢方薬)を例に構築されました。クラスター分析(CA)、主成分分析(PCA)、直交部分最小二乗弁別分析(OPLS-DA)を含むケモメトリックスと組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)フィンガープリントに基づいて、本物のチュアンムトン品種の10バッチと関連する不純物の5バッチを分析および比較しました。さらに、β-シトステロールの含有量を測定した。チュアンムートンの対照化学的指紋が確立され、12の一般的なピークが特定されました。本物のチュアンムトン品種の10バッチの指紋と対照指紋の類似性は0.910〜0.989でしたが、5バッチの混入物の類似性はわずか0.133〜0.720でした。クロマトグラムの一般的なピークに基づいて、15バッチのサンプルがPCAによって3つの含有量レベルに分類され、CAによって4つのカテゴリに集約され、本物のチュアンムトンとチュアンムートンの不純物を明確に区別しました。さらに、OPLS-DAを通じて、本物のチュアンムトンとチュアンムトンの不純物を効果的に識別できる7つの差動成分が見つかりました。本物のチュアンムトン品種の10バッチのβ-シトステロール含有量は97.53-161.56μg / gでしたが、偽和物の5つのバッチのβ-シトステロール含有量は大きく異なり、その中で クレマチスペテラエ ハンドのβ-シトステロール含有量。と クレマチス・グリアナ・ ロクスブ。Var. finetii Rehd.エトウィルズ。チュアンムートンの本物の品種よりも大幅に低かった。本研究で確立されたHPLC指数成分含有量と化学指紋マルチパターン認識法は、本物の漢方薬材料および関連する不純物を効果的に識別するための新しい戦略を提供します。
Introduction
チュアンムトン、クレマチスアルマンディフランシュのドライカリス。またはクレマチスモンタナBuch.-Ham.は、クリニック1,2,3で一般的に使用される伝統的な漢方薬です。尿の問題、浮腫、舌や口の痛み、乳汁分泌の低下、関節のこわばり、湿った熱によって引き起こされる筋肉痛の治療に使用されます4。Chuanmutongは常に野生品種から得られており、主に中国南西部、特に四川省に分布しており、最高の品質が見られます5,6。本物の品種とそれらの密接に関連する不純物を区別することは困難です7,8,9,10。中国薬局方の2020年版のChuanmutongの品質基準は、含有量決定なしの特性、顕微鏡識別、および薄層識別のみを規定しており、偽和物を効果的に識別できないため、潜在的なリスクがあります。さらに、チュアンムトンと関連植物を比較および特定した報告はほとんどありません。したがって、チュアンムトンの信憑性を確保するための品質管理方法は、さらに研究する価値があります。
チュアンムートンの化学成分は、主にオレアナン型五環式トリテルペノイドとその配糖体、フラボノイド、および有機酸で構成されています11,12,13,14。その中で、オレアノール酸、β−シトステロール、スチグマステロール、およびエルゴステロールは、異なる強度の利尿作用を有し、これは、利尿を促進し、絞尿を緩和するための潜在的な薬力学的物質であり得る15,16。化学指紋は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)などによってサンプルに含まれる多くの化学成分を分離して検出することによって得られます。Chuanmutongの特性を分析するために適切な統計分析方法を採用することで、伝統的な漢方薬の全体的な品質管理と科学的識別を決定できます17,18,19。
この研究では、チュアンムトン本物の品種の10バッチと偽和物の5バッチが収集されました。それらの品質は、クラスター分析(CA)、主成分分析(PCA)、直交部分最小二乗弁別分析(OPLS-CA)、および薬力学的成分の含有量決定を含むマルチパターン認識と組み合わせたHPLCフィンガープリント法によって比較および分析されました。このプロトコルは、高い特異性を持つ本物の品種を識別するための方法を確立し、本物の品種と中国の医薬品の不純物を科学的に識別するための新しい戦略を確立します。
Protocol
1.化学的指紋検出方法 クロマトグラフィー条件アセトニトリル(A)/水(B)移動相を準備します。HPLCソフトウェアで次のようにグラジエントプログラムを設定します:0-20分、3%A-10%A;20-25分、10%A-13%A;25-65分、13%A-25%A;65-75分、25%A-40%A;75-76分、40%A-3%A;76-85分、3%A-3%A。 移動相の流量を1.0 mL/分に維持します。 30°Cに維持したC18カラム(250 mm x 4.6 mm、5 μm)でクロマトグ?…
Representative Results
チュアンムートンのクロマトグラフィーフィンガープリントと類似性分析(SA)精度、再現性、安定性の相対保持時間のRSD値は、それぞれ0.46%、1.65%、0.53%未満でした。相対ピーク面積のRSD値は、それぞれ4.23%、3.56%、3.96%未満でした。 図1A、Bに示すように、10個の本物のチュアンムトンサンプルのHPLCフィンガープリントには、12個の異なる共通ピ?…
Discussion
研究用のサンプルコレクションは、漢方薬の真正性を特定する際のマルチパターン認識を構築するための最初の重要なステップです。市場調査を通じて、四川亜安、梁山、楽山が川和通の野生資源の主な生産地であることがわかりました。同じ属の関連品種も同じ地理的分布を持っています6,20;CC、DC、DE、XS、およびSMTは、チュアンムトン<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、四川省中医薬管理局のプロジェクト(番号2020JC0088、番号2021MS203)によってサポートされました。
Materials
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | – | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | – | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | – | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | – | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | – | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
Referências
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Citar este artigo
Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng, J., Huang, D., Liu, Q., Xie, X. HPLC Coupled with Chemical Fingerprinting for Multi-Pattern Recognition for Identifying the Authenticity of Clematidis Armandii Caulis. J. Vis. Exp. (189), e64690, doi:10.3791/64690 (2022).