ВЭЖХ в сочетании с химическими отпечатками пальцев для распознавания нескольких образов для идентификации подлинности Clematidis Armandii Caulis
Summary
Здесь мы представляем протокол для создания высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с химическим распознаванием отпечатков пальцев с несколькими образами, который обеспечивает новую стратегию эффективной идентификации подлинных сортов Clematidis Armandii Caulis и его фальсификаторов.
Abstract
Метод идентификации китайских лекарственных материалов и связанных с ними фаяльсий был построен на примере Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, повсеместно используемая традиционная китайская медицина). Десять партий подлинных сортов Чуаньмутонг и пять партий родственных фальсификатов были проанализированы и сопоставлены на основе высокоэффективных отпечатков пальцев жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с хемометрией, включая кластерный анализ (CA), анализ главных компонентов (PCA) и ортогональный частичный анализ дискриминации наименьших квадратов (OPLS-DA). Кроме того, определяли содержание β-ситостерина. Контрольный химический отпечаток Чуаньмутонга был установлен, и было идентифицировано 12 общих пиков. Сходство между отпечатком пальца 10 партий подлинных разновидностей Chuanmutong и контрольным отпечатком пальца составляло 0,910-0,989, в то время как сходство пяти партий фальсификатов составляло всего 0,133-0,720. Основываясь на общих пиках в хроматограмме, 15 партий образцов были классифицированы по трем уровням содержания PCA и были агрегированы в четыре категории CA, что позволило провести четкое различие между подлинными chuanmutong и фальсификатами Chuanmutong. Кроме того, семь дифференциальных компонентов, которые могут эффективно идентифицировать подлинный Чуаньмутонг и фальсификаторы Чуаньмутонга, были обнаружены с помощью OPLS-DA. Содержание β-ситостерина в 10 партиях подлинных сортов Чуаньмутонг составляло 97,53-161,56 мкг/г, в то время как содержание β-ситостерола в пяти партиях фальсификатов сильно варьировалось, среди которых содержание β-ситостерола в Клематис петера Хэнд.-Мазз. и Клематис гуриана Роксб. Var. finetii Rehd. и Уилс. был значительно ниже, чем у аутентичных сортов Чуаньмутонг. Содержание компонентов индекса ВЭЖХ и химический метод распознавания нескольких образов отпечатков пальцев, установленный в этом исследовании, обеспечивают новую стратегию эффективной идентификации подлинных китайских лекарственных материалов и связанных с ними фальсификатов.
Introduction
Чуаньмутонг, сухой каулис клематиса армандии Франч. или Clematis montana Buch.-Ham., является традиционной китайской медициной, обычно используемой в клиниках 1,2,3. Он используется для лечения проблем с мочеиспусканием, отеков, язв на языке и во рту, снижения секреции молока, жесткости суставов и мышечной боли, вызваннойвлажным теплом 4. Чуаньмутонг всегда получали из диких сортов, в основном распространенных на юго-западе Китая, особенно в провинции Сычуань, где лучшее качество можно найти 5,6. Трудно отличить аутентичные сорта от их близкородственных фальсификаторов из-за их схожих характеристик 7,8,9,10. Стандарт качества Chuanmutong в издании Китайской фармакопеи 2020 года предусматривает только свойства, микроскопическую идентификацию и тонкослойную идентификацию без определения содержания, которая не может эффективно идентифицировать фальсификаторов и, следовательно, имеет потенциальные риски. Кроме того, существует мало сообщений, сравнивающих и идентифицирующих Чуаньмутонг и родственные растения. Следовательно, метод контроля качества для обеспечения подлинности Chuanmutong заслуживает дальнейшего изучения.
Химические компоненты Chuanmutong в основном состоят из пентациклических тритерпеноидов типа олеана и их гликозидов, флавоноидов и органических кислот 11,12,13,14. Среди них олеаноловая кислота, β-ситостерин, стигмастерин и эргостерин обладают мочегонным действием различной интенсивности, которые могут быть потенциальными фармакодинамическими веществами для стимулирования диуреза и облегчения странгурии15,16. Химические отпечатки пальцев получают путем разделения и обнаружения многих химических компонентов, содержащихся в образцах, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газовой хроматографии (ГХ) и т.д. Принятие соответствующих методов статистического анализа для анализа характеристик Chuanmutong может определить общий контроль качества и научную идентификацию традиционной китайской медицины 17,18,19.
В этом исследовании было собрано 10 партий аутентичных сортов Чуаньмутонг и пять партий фальсификатов. Их качество сравнивалось и анализировалось методом отпечатков пальцев ВЭЖХ в сочетании с распознаванием нескольких образов, включая кластерный анализ (CA), анализ главных компонентов (PCA), ортогональный частичный анализ дискриминации наименьших квадратов (OPLS-CA) и определение содержания фармакодинамического компонента. Этот протокол устанавливает метод идентификации аутентичных сортов с высокой специфичностью, новую стратегию научной идентификации аутентичных сортов и фальсификатов китайских лекарственных материалов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сбор образцов для исследований является первым ключевым шагом к построению многоконтактного распознавания в определении подлинности китайских лекарственных материалов. Благодаря исследованию рынка мы обнаружили, что Сычуань Яань, Ляншань и Лэшань являются основными районами добыч?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Проектом Администрации традиционной китайской медицины провинции Сычуань (No 2020JC0088, No 2021MS203).
Materials
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | – | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | – | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | – | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | – | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | – | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | – | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
Referências
- Chen, C. R. . Chinese Medicine Specimen Picture Book. , 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. . Pharmacopoeia of The People’s Republic of China: (Edition 2020). , 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
