Analyse af rå og forarbejdede Cyperi rhizoma-prøver ved hjælp af væskekromatografi-tandemmassespektrometri hos rotter med primær dysmenoré

Summary

Her præsenteres en sammenlignende analyse af rå og forarbejdede Cyperi rhizoma (CR) prøver ved hjælp af ultra-højtydende væskekromatografi-tandem massespektrometri med høj opløsning (UPLC-MS / MS) hos rotter med primær dysmenoré. Ændringerne i blodets indhold af metabolitterne og prøvebestanddelene blev undersøgt mellem rotter behandlet med CR og CR behandlet med eddike (CRV).

Abstract

Cyperi rhizoma (CR) er meget udbredt i gynækologi og er en generel medicin til behandling af kvinders sygdomme i Kina. Da den smertestillende virkning af CR forbedres efter forarbejdning med eddike, anvendes CR behandlet med eddike (CRV) generelt klinisk. Den mekanisme, hvormed den smertestillende virkning forbedres ved eddikebehandling, er imidlertid uklar. I denne undersøgelse blev teknikken med ultrahøjtryksvæskekromatografitandem massespektrometri (UPLC-MS/MS) anvendt til at undersøge ændringer i blodets indhold af eksogene bestanddele og metabolitter mellem CR-behandlede og CRV-behandlede rotter med dysmenoré. Resultaterne afslørede forskellige niveauer af 15 bestanddele og to metabolitter i blodet hos disse rotter. Blandt dem var niveauerne af (-)-myrtenol og [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]eddikesyre i CRV-gruppen betydeligt højere end i CR-gruppen. CRV reducerede niveauet af 2-serie prostanoider og 4-serie leukotriener med proinflammatoriske, blodpladeaggregering og vasokonstriktionsaktiviteter og tilvejebragte smertestillende virkninger ved at modulere arachidonsyre og linolsyremetabolisme og biosyntese af umættede fedtsyrer. Denne undersøgelse afslørede, at eddikeforarbejdning forbedrer den smertestillende virkning af CR og bidrager til vores forståelse af virkningsmekanismen for CRV.

Introduction

Primær dysmenoré (PD) er den mest udbredte tilstand i klinisk gynækologi. Det er kendetegnet ved rygsmerter, hævelse, mavesmerter eller ubehag før eller under menstruation uden bækkenpatologi i reproduktionssystemet¹. En rapport om dens udbredelse viste, at 85,7% af eleverne lider af PD². Lavdosis orale præventionsmidler er standardbehandlingen, men deres bivirkninger, såsom dyb venetrombose, har tiltrukket stigende opmærksomhed³. Forekomsten af dyb venetrombose blandt orale præventionsbrugere er >1 pr. 1.000 kvinder, og risikoen er højest i de første 6-12 måneder og hos brugere over 40 år⁴.

Længe brugt i traditionel kinesisk medicin (TCM), Cyperi rhizoma (CR) er afledt af det tørrede rhizom af Cyperus rotundus L. af Cyperaceae familien. CR regulerer menstruationsforstyrrelser og lindrer depression og smerter⁵. CR er meget udbredt i gynækologi og betragtes som en generel medicin til behandling af kvinders sygdomme⁶. CR behandlet med eddike (CRV) anvendes typisk klinisk. Sammenlignet med CR viser CRV forbedret regulering af menstruation og smertelindring. Moderne undersøgelser har vist, at CR hæmmer cyclooxygenase-2 (COX-2) og den efterfølgende syntese af prostaglandiner (PG’er) og derved opnår en antiinflammatorisk virkning. I mellemtiden udviser CR en smertestillende effekt uden bivirkninger⁷, hvilket gør CR til et godt valg for dysmenorépatienter. Imidlertid er mekanismen bag reguleringen af menstruation og tilvejebringelse af smertelindring ved CRV uklar. CR-forskning har primært fokuseret på ændringer i dets aktive kemiske komponenter og farmakologiske aktiviteter, såsom dets antiinflammatoriske, antidepressive og smertestillende virkninger 8,9,10,11,12.

Selvom ingredienserne i TCM er komplekse, absorberes de i blodet og skal nå en bestemt blodkoncentration for at være effektiv¹³. Omfanget af screening af de aktive ingredienser i TCM kan indsnævres ved at udnytte strategien for bestanddelsbestemmelse i blodet. Blindhed kan undgås ved undersøgelse af de kemiske komponenter in vitro, og ensidighed kan undgås ved undersøgelse af de enkelte bestanddele¹⁴. Ved at sammenligne sammensætningerne af CR og CRV i blodet kan ændringer i de aktive ingredienser i den forarbejdede CR detekteres effektivt og hurtigt. Lægemiddeleffektivitet er den proces, hvormed et lægemiddel påvirker kroppen. Ændringer i lægemiddelkomponenterne på grund af kroppens metaboliske respons, som kan være relateret til lægemidlets virkningsmekanisme, kan bestemmes med metabonomics. Metabonomics sigter mod at måle de samlede og dynamiske metaboliske reaktioner, hvilket er i overensstemmelse med bestemmelsen af den samlede effekt af traditionel kinesisk medicin¹⁵. Desuden er metabolitter det endelige produkt af genekspression, som er tættest beslægtet med fænotype¹⁶. Således kan metabonomics være egnet til at udforske forskellene i de metaboliske veje mellem CR og CRV i behandlingen af PD. Væskekromatografi-tandemmassespektrometri med høj opløsning (LC-MS/MS)-baseret ikke-målrettet metabolomics er kendetegnet ved høj gennemstrømning, høj følsomhed og høj opløsning og kan bruges til at måle mange forskellige små molekylære komponenter^17,18 . Denne metode kan samtidig bestemme de endogene metabolitter og eksogene bestanddele, der absorberes i blodet. Metabonomics har været meget udbredt i undersøgelser af TCM¹⁹, narkotikatoksikologi 20, sundhedsstyring 21, sport^{22, mad 23} og andre områder.

I denne undersøgelse blev forskellene i de eksogene bestanddele, der blev absorberet i blodet, og de endogene metabolitter målt mellem CR-behandlede og CRV-behandlede dysmenorémodelrotter ved hjælp af LC-MS / MS-baserede ikke-målrettede metabolomics for at afsløre mekanismerne for de smertestillende virkninger af CRV.

Protocol

Alle dyrerelaterede eksperimenter blev udført med godkendelse fra Experiment Ethics Committee of Chongqing Institute of TCM. Fireogtyve kvindelige Sprague Dawley rotter (SD), der var 8-10 uger gamle og vejede 200 g ± 20 g, blev brugt i dette forsøg. 1. Forberedelse af ekstraktionen BeregningPlanlæg at administrere CR- eller CRV-ekstraktet til en behandlingsgruppe på seks Sprague-Dawley-rotter (10 g/[kg∙dag]) i 3 dage. Brug en CR- eller CRV-ekstraktkonc…

Representative Results

Analyse af dysmenoré model eksperimentDer var ingen vridende respons inden for 30 minutter i kontrolgruppen, fordi disse rotter ikke blev intraperitonealt injiceret med oxytocin og østradiolbenzoat for at forårsage smerte. Rotterne i model-, CR- og CRV-grupperne udviste betydelige vridende reaktioner efter oxytocininjektionen. Disse resultater viser effekten af østradiolbenzoat- og oxytocinkombinationen til inducering af dysmenoré. Forskellene i PGF 2α, PGE 2 og PGF2α/PGE…

Discussion

På grund af TCM’ernes store variation og forskellige karakter virker disse urter undertiden ikke i klinisk praksis, og det kan skyldes uhensigtsmæssig behandling og decocting af TCM’er. TCM’s mekanismer bliver mere tydelige med brugen af nutidig videnskab og teknologi ^29,30. Denne undersøgelse viser, at både CR og CRV har terapeutiske virkninger i PD-modelrotter, og at den terapeutiske effekt af CRV er mere omfattende. Virkningsmekanismen for CRV kan være re…

Materials

Acetonitrile	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20	Beckman Coulter, Inc.	MRZ15K047
Estradiol benzoate	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	C10042616
formic acid	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	177799
LC 30A system	Shimadzu, Kyoto, Japan	228-45162-46
Olive oil	Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd	H25A11P111909
Oxytocin synthetic	Zhejiang peptide biology Co., Ltd	2019092001
Rat PGF2α ELISA kit	Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd	202101
Rat PGFE2 ELISA kit	Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd	EDL202006217
SPF Sprague-Dawley rats	Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd	Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
Triple TOF 4600 system	SCIEX, Framingham, MA, USA	BK20641402
water	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	152720