लिवर रोग अध्ययन के लिए परिधीय रक्त से मानव यकृत स्फेरॉइड
Summary
यहां हम स्थिर-अवस्था परिधीय रक्त से पृथक मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का उपयोग करके मानव ऑटोलॉगस लिवर स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए एक गैर-आनुवंशिक विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
मानव यकृत कोशिकाएं एक त्रि-आयामी (3 डी) संरचना बना सकती हैं जो कुछ हफ्तों के लिए संस्कृति में बढ़ने में सक्षम हैं, उनकी कार्यात्मक क्षमता को संरक्षित करती हैं। कम या बिना चिपकने वाली विशेषताओं वाले संस्कृति व्यंजनों में क्लस्टर करने की उनकी प्रकृति के कारण, वे कई यकृत कोशिकाओं के समुच्चय बनाते हैं जिन्हें मानव यकृत स्फेरॉइड कहा जाता है। 3 डी लिवर स्फेरॉइड का गठन एक चिपकने वाला सब्सट्रेट की अनुपस्थिति में एकत्रित होने के लिए यकृत कोशिकाओं की प्राकृतिक प्रवृत्ति पर निर्भर करता है। इन 3 डी संरचनाओं में कोशिकाओं की तुलना में बेहतर शारीरिक प्रतिक्रियाएं होती हैं, जो विवो वातावरण के करीब होती हैं। शास्त्रीय दो-आयामी (2 डी) संस्कृतियों की तुलना में 3 डी हेपेटोसाइट संस्कृतियों का उपयोग करने से कई फायदे होते हैं, जिसमें अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक माइक्रोएन्वायरमेंट, वास्तु आकृति विज्ञान शामिल है जो प्राकृतिक अंगों को फिर से इकट्ठा करता है और साथ ही रोग की स्थिति और दवाओं के लिए विवो जैसी प्रतिक्रियाओं के बारे में बेहतर भविष्यवाणी करता है। स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए विभिन्न स्रोतों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे प्राथमिक यकृत ऊतक या अमर सेल लाइनें। हेपेटोसाइट्स प्राप्त करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) का उपयोग करके 3 डी यकृत ऊतक को भी इंजीनियर किया जा सकता है। हमने मानव झिल्ली-बाध्य जीपीआई-लिंक्ड प्रोटीन के सक्रियण द्वारा और मानव हेपेटोसाइट्स में विभेदित करके अनियंत्रित परिधीय रक्त से उत्पन्न रक्त-व्युत्पन्न प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (बीडी-पीएससी) का उपयोग करके मानव यकृत स्फेरॉइड प्राप्त किया है। बीडी-पीएससी-व्युत्पन्न मानव यकृत कोशिकाओं और मानव यकृत स्फेरॉइड का विश्लेषण मानव हेपेटोसाइट मार्करों का उपयोग करके प्रकाश माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोफेनोटाइपिंग द्वारा किया गया था।
Introduction
हाल के वर्षों में तीन आयामी (3 डी) स्फेरॉइड संस्कृति प्रणाली कैंसर अनुसंधान, दवा की खोज और विष विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गई है। ऐसी संस्कृतियां बहुत रुचि पैदा करती हैं क्योंकि वे दो-आयामी (2 डी) सेल कल्चर मोनोलेयर और जटिल अंगों के बीच की खाईको पुल करती हैं।
चिपकने वाली सतह की अनुपस्थिति में, 2 डी सेल संस्कृति की तुलना में, स्फेरॉइड का गठन इन कोशिकाओं के 3 डी रूप में क्लस्टर करने के लिए प्राकृतिक संबंध पर आधारित है। ये कोशिकाएं खुद को एक या अधिक प्रकार की परिपक्व कोशिकाओं से मिलकर समूहों में व्यवस्थित करती हैं। विदेशी सामग्रियों से मुक्त, ये कोशिकाएं अपने मूल माइक्रोएन्वायरमेंट की तरह एक दूसरे के साथ बातचीत करती हैं। 3 डी संस्कृति में कोशिकाएं बहुत करीब हैं और 2 डी संस्कृतियों की तुलना में उच्च बाह्य मैट्रिक्स उत्पादन के साथ एक दूसरे के प्रति उचित अभिविन्यास है, और प्राकृतिक वातावरण 2 के करीब हैं।
मानव जीव विज्ञान और रोगों का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल का उपयोग लंबे समय से किया गयाहै। इस संबंध में, मनुष्यों और जानवरों के बीच आंतरिक अंतर हैं, जो इन मॉडलों को पूरी तरह से अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं बनाता है। 3 डी कल्चर स्फेरॉइड और ऑर्गेनोइडविवो में होने वाले विभिन्न सेल प्रकारों के बीच ऊतक जैसी वास्तुकला, बातचीत और क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं और पशु मॉडल को कम करने या यहां तक कि प्रतिस्थापित करने में योगदान कर सकते हैं। वे यकृत रोगों के रोगजनन के साथ-साथ दवा स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म4 का अध्ययन करने के लिए विशेष रुचि रखते हैं।
3 डी स्फेरॉइड कल्चर कैंसर अनुसंधान के लिए विशेष महत्व का है क्योंकि यह 2 डी संस्कृतियों के लिए ट्यूमर सेल मोनोलेयर तैयार करने के लिए आवश्यक ट्रिप्सिनाइजेशन या कोलेजनेज उपचार की आवश्यकता को कम करके कोशिकाओं और उनके पर्यावरण के बीच अलगाव को खत्म कर सकता है। ट्यूमर स्फेरॉइड इस अध्ययन को सक्षम करते हैं कि सामान्य बनाम घातक कोशिकाएं अपने परिवेश से संकेतों को कैसे प्राप्त करती हैं और प्रतिक्रिया देती हैं5 और ट्यूमर जीव विज्ञान अध्ययन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं।
मोनोलेयर की तुलना में, विभिन्न सेल प्रकारों से युक्त 3 डी संस्कृतियां अपने संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों में ट्यूमर ऊतकों से मिलती-जुलती हैं और इसलिए मेटास्टेसिस और ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं। यही कारण है कि इस तरह के स्फेरॉइड मॉडलकैंसर अनुसंधान में तेजी लाने में योगदान दे रहे हैं।
स्फेरॉइड मानव ऑर्गेनोइड बनाने के लिए तकनीक विकसित करने में भी मदद कर रहे हैं क्योंकि ऊतक और अंग जीव विज्ञान अध्ययन करने के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण हैं, खासकर मनुष्यों में। स्टेम सेल संस्कृति में प्रगति 3 डी संस्कृतियों को विकसित करना संभव बनाती है जैसे स्टेम कोशिकाओं और ऊतक पूर्वजों के साथ-साथ एक अंग से विभिन्न प्रकार की परिपक्व (ऊतक) कोशिकाएं एक वास्तविक अंग की तरह कुछ कार्यात्मक विशेषताओं के साथ होती हैं जिनका उपयोग अंग विकास, रोगों को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन उन्हें पुनर्योजी चिकित्सा में भी उपयोगी माना जा सकताहै।
प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट्स का उपयोग आमतौर पर मानव हेपेटोसाइट्स, यकृत समारोह और दवा-प्रेरित विषाक्तता के इन विट्रो जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। मानव हेपेटोसाइट्स की संस्कृतियों में दो मुख्य कमियां हैं, सबसे पहले, मानव हेपेटोसाइट्स जैसे प्राथमिक ऊतक की सीमित उपलब्धता, और दूसरा, हेपेटोसाइट्स की प्रवृत्ति 2 डी संस्कृति में तेजी से विभेदित होती है जिससे उनके विशिष्ट हेपेटोसाइट फ़ंक्शन 8 को खो दियाजाता है। 3 डी हेपेटिक संस्कृतियां इस संबंध में बेहतर हैं और हाल ही में विभेदित मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) 9 से बनाई गई हैं। बायोइंजीनियर्ड हेपेटिक 3 डी स्फेरॉइड यकृत के विकास, विषाक्तता, आनुवंशिक और संक्रामक रोगों का अध्ययन करने के लिए विशेष रुचि रखते हैं, साथ ही यकृत रोगों के उपचार के लिए दवा की खोज मेंभी 10. अंत में, उनके पास चिकित्सकीय रूप से उपयोग किए जाने की क्षमता भी है, यह जानते हुए कि तीव्र यकृत रोगों की मृत्यु दर लगभग 80% है, जैव-कृत्रिम यकृत और / या हेपेटिक स्फेरॉइड संभावित रूप से आंशिक यकृत समारोह प्रदान करके इन रोगियों को बचा सकतेहैं जब तक कि एक उपयुक्त दाता नहीं मिल सकता है।
हमने रक्त-व्युत्पन्न प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (बीडी-पीएससी) का उपयोग करके मानव यकृत स्फेरॉइड की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है ताकि 4000 से 1 x 106 कोशिकाओं वाले अलग-अलग आकार के स्फेरॉइड तैयार किए जा सकें और प्रकाश माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से उनका विश्लेषण किया जा सके। हमने हेपेटोसाइट-विशिष्ट फ़ंक्शन की क्षमता का भी परीक्षण किया, साइटोक्रोम पी 450 3 ए 4 (सीवाईपी 3 ए 4) और 2 ई 1 (सीवाईपी 2 ई 1) एंजाइमों की अभिव्यक्ति का आकलन किया जो साइटोक्रोम पी 450 परिवार से संबंधित हैं जिनकी विषहरण की प्रक्रिया के माध्यम से सेलुलर और दवा चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिकाहै।
Protocol
Representative Results
Discussion
यकृत मानव शरीर में कई आवश्यक जैविक कार्यों के साथ एक प्रमुख अंग है, जैसे मेटाबोलाइट्स का विषहरण। सिरोसिस और / या वायरल हेपेटाइटिस जैसी गंभीर जिगर विफलताओं के कारण, दुनिया भर में प्रति वर्ष लगभग 2 मिलियन ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ओक्साना और जॉन ग्रीनक्रे द्वारा प्रदान की गई तकनीकी सहायता के लिए विशेष रूप से आभारी हैं। इस काम को एसीए सेल बायोटेक जीएमबीएच हीडलबर्ग, जर्मनी द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
Referências
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease – A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
