간 질환 연구를 위한 말초 혈액의 인간 간 스페로이드
Summary
여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.
Abstract
인간의 간 세포는 기능적 능력을 유지하면서 몇 주 동안 배양에서 성장할 수 있는 3차원(3D) 구조를 형성할 수 있습니다. 접착 특성이 낮거나 전혀 없는 배양 접시에 군집하는 특성으로 인해 인간 간 스페로이드라고 하는 여러 간 세포의 응집체를 형성합니다. 3D 간 스페로이드의 형성은 접착 기질이 없을 때 응집되는 간 세포의 자연적인 경향에 의존합니다. 이러한 3D 구조는 생체 내 환경에 더 가까운 세포보다 더 나은 생리적 반응을 보입니다. 3D 간세포 배양을 사용하면 생물학적으로 더 관련성이 높은 미세 환경, 자연 장기를 재조립하는 구조적 형태, 질병 상태 및 약물 에 대한 생체 내 유사 반응에 대한 더 나은 예측을 포함하여 기존의 2차원(2D) 배양과 비교할 때 많은 이점이 있습니다. 다양한 소스를 사용하여 일차 간 조직 또는 불멸화된 세포주와 같은 스페로이드를 생성할 수 있습니다. 3D 간 조직은 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)를 사용하여 간세포를 유도함으로써 조작될 수도 있습니다. 인체 막 결합 GPI 연계 단백질의 활성화에 의해 조작되지 않은 말초혈액에서 생성되고 인간 간세포로 분화된 혈액유래만능줄기세포(BD-PSC)를 이용하여 인간 간 스페로이드를 획득하였습니다. BD-PSCs 유래 인간 간 세포 및 인간 간 스페로이드를 인간 간세포 마커를 사용하여 광학 현미경 및 면역 표현형으로 분석하였다.
Introduction
최근 몇 년 동안 3차원(3D) 스페로이드 배양 시스템은 암 연구, 약물 발견 및 독성학의 다양한 영역을 연구하는 중요한 도구가 되었습니다. 이러한 배양은 2차원(2D) 세포 배양 단층과 복잡한 기관 사이의 간극을 메우기 때문에 큰 관심을 불러일으킨다1.
접착 표면이 없는 경우, 2D 세포 배양과 비교하여 스페로이드의 형성은 3D 형태로 클러스터링되는 이러한 세포의 자연스러운 친화력을 기반으로 합니다. 이 세포는 하나 이상의 유형의 성숙한 세포로 구성된 그룹으로 구성됩니다. 이물질이 없는 이 세포는 원래의 미세 환경에서와 같이 서로 상호 작용합니다. 3D 배양의 세포는 2D 배양보다 세포외 기질 생산이 더 높아 훨씬 더 가깝고 서로를 향한 적절한 방향을 가지며 자연 환경에 가깝습니다 2.
동물 모델은 인간의 생물학과 질병을 연구하기 위해 오랫동안 사용되어 왔습니다3. 이와 관련하여 인간과 동물 사이에는 본질적인 차이가 있기 때문에 이러한 모델은 외계 연구에 완전히 적합하지 않습니다. 3D 배양 스페로이드 및 오가노이드는 생체 내에서 발생하는 다양한 세포 유형 간의 조직과 유사한 구조, 상호 작용 및 누화를 연구하는 유망한 도구이며 동물 모델을 줄이거나 대체하는 데 기여할 수 있습니다. 그들은 간 질환의 발병 기전과 약물 스크리닝 플랫폼을 연구하는 데 특히 관심이 있습니다4.
3D 스페로이드 배양은 2D 배양을 위한 종양 세포 단층을 준비하는 데 필요한 트립신 처리 또는 콜라게나제 처리의 필요성을 줄여 세포와 환경 간의 불연속성을 제거할 수 있기 때문에 암 연구에 특히 중요합니다. 종양 스페로이드는 정상 세포와 악성 세포가 주변 환경으로부터 어떻게 신호를 받고 반응하는지에 대한 연구를 가능하게 하며5 종양 생물학 연구의 중요한 부분이다.
단층에 비해 다양한 세포 유형으로 구성된 3D 배양은 구조적 및 기능적 특성에서 종양 조직과 유사하므로 종양 세포의 전이 및 침윤을 연구하는 데 적합합니다. 이것이 바로 이러한 스페로이드 모델이 암 연구를 가속화하는 데 기여하는 이유입니다6.
스페로이드는 또한 조직 및 장기 생물학, 특히 인간에서 연구하기가 매우 어렵기 때문에 인간 오가노이드를 만드는 기술을 개발하는 데 도움이 됩니다. 줄기세포 배양이 진행됨에 따라 줄기세포와 조직 전구체로 구성된 오가노이드와 같은 3D 배양을 개발할 수 있을 뿐만 아니라 실제 장기와 같은 기능적 특성을 가진 장기의 다양한 유형의 성숙(조직) 세포를 개발할 수 있어 장기 발달, 질병을 모델링하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 재생 의학7에서도 유용하다고 간주될 수 있다.
1차 인간 간세포는 일반적으로 인간 간세포, 간 기능 및 약물 유발 독성의 시험관 내 생물학을 연구하는 데 사용됩니다. 인간 간세포의 배양은 두 가지 주요 단점을 가지고 있는데, 첫째, 인간 간세포와 같은 일차 조직의 가용성이 제한적이고, 둘째, 간세포가 2D 배양에서 빠르게 역분화되어 특정 간세포 기능을 상실하는 경향이 있다8. 3D 간 배양은 이와 관련하여 우수하며 최근에는 분화된 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로 만들어졌습니다9. 생체공학적 간 3D 스페로이드는 간 질환 치료를 위한 약물 발견뿐만 아니라 간의 발달, 독성, 유전 및 감염성 질환을 연구하는 데 특히 중요합니다10. 마지막으로, 급성 간 질환의 치사율이 거의 80%에 달한다는 사실을 알기 때문에 임상적으로 사용될 수 있는 가능성도 있으며, 생체 인공 간 및/또는 간 스페로이드는 적절한 기증자를 찾을 때까지 부분적인 간 기능을 제공함으로써 이러한 환자들을 잠재적으로 구제할 수 있다11.
우리는 혈액 유래 만능 줄기 세포(BD-PSC)를 사용하여 4000 내지 1 x 106 세포를 포함하는 다양한 크기의 스페로이드를 제조하고 광학 현미경 및 면역형광을 통해 분석하는 인간 간 스페로이드 생성을 위한 프로토콜을 확립했습니다. 또한 해독 과정을 통해 세포 및 약물 대사에 중요한 역할을 하는 시토크롬 P450 계열에 속하는 시토크롬 P450 3A4(CYP3A4) 및 2E1(CYP2E1) 효소의 발현을 평가하여 간세포 특이적 기능의 능력을 테스트했습니다12.
Protocol
Representative Results
Discussion
간은 대사 산물의 해독과 같은 많은 필수 생물학적 기능을 가진 인체의 주요 기관입니다. 간경변 및/또는 바이러스성 간염과 같은 심각한 간부전으로 인해 전 세계적으로 연간 거의 200만 명이 사망합니다. 간 이식은 전 세계적으로 고형 장기 이식에서 2위를 차지하지만 현재 수요의 약 10%만이 충족됩니다22.
원발성 인간 간세포(PHH)는 종종 간 독성을 연구하는…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 특히 Oksana와 John Greenacre가 제공 한 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 독일 하이델베르크에 있는 ACA CELL Biotech GmbH의 지원을 받았습니다.
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
Referências
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