Сфероиды печени человека из периферической крови для исследований заболеваний печени
Summary
Здесь мы представляем негенетический метод получения аутологичных сфероидов печени человека с использованием мононуклеарных клеток, выделенных из стационарной периферической крови.
Abstract
Клетки печени человека могут образовывать трехмерную (3D) структуру, способную расти в культуре в течение нескольких недель, сохраняя свою функциональную способность. Из-за своей природы группироваться в культуральных чашках с низкими или отсутствующими адгезионными характеристиками они образуют агрегаты из нескольких клеток печени, которые называются сфероидами печени человека. Формирование 3D-сфероидов печени зависит от естественной склонности печеночных клеток к агрегации в отсутствие адгезивного субстрата. Эти 3D-структуры обладают лучшими физиологическими реакциями, чем клетки, которые ближе к среде in vivo . Использование 3D-культур гепатоцитов имеет множество преимуществ по сравнению с классическими двумерными (2D) культурами, включая более биологически значимое микроокружение, архитектурную морфологию, которая воссобирает естественные органы, а также лучшее прогнозирование состояния болезни и реакций in vivo на лекарства. Для получения сфероидов могут использоваться различные источники, такие как первичная ткань печени или иммортализированные клеточные линии. 3D-ткань печени также может быть сконструирована с использованием эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) для получения гепатоцитов. Мы получили сфероиды печени человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови (BD-PSCs), полученных из необработанной периферической крови путем активации связанного с мембраной GPI-связанного белка человека и дифференцированного в гепатоциты человека. Клетки печени человека, полученные из BD-PSCs, и сфероиды печени человека были проанализированы с помощью световой микроскопии и иммунофенотипирования с использованием маркеров гепатоцитов человека.
Introduction
В последние годы трехмерные (3D) системы культивирования сфероидов стали важным инструментом для изучения различных областей исследований рака, открытия лекарств и токсикологии. Такие культуры вызывают большой интерес, поскольку они устраняют разрыв между двумерными (2D) монослоями клеточных культур и сложными органами1.
При отсутствии адгезивной поверхности, по сравнению с 2D-культурой клеток, образование сфероидов основано на естественном сродстве этих клеток к кластеризации в 3D-форме. Эти клетки организуются в группы, состоящие из одного или нескольких типов зрелых клеток. Свободные от чужеродных материалов, эти клетки взаимодействуют друг с другом, как в своем первоначальном микроокружении. Клетки в 3D-культуре намного ближе и имеют правильную ориентацию друг к другу, с более высокой продукцией внеклеточного матрикса, чем в 2D-культурах, и представляют собой близкую к естественной среду 2.
Модели на животных уже давно используются для изучения биологии и болезней человека3. В связи с этим существуют внутренние различия между людьми и животными, что делает эти модели не совсем пригодными для экстраполятивных исследований. Сфероиды и органоиды 3D-культур представляют собой многообещающий инструмент для изучения тканеподобной архитектуры, взаимодействия и перекрестных помех между различными типами клеток, которые происходят in vivo и могут способствовать уменьшению или даже замене моделей животных. Они представляют особый интерес для изучения патогенеза заболеваний печени, а также платформ скрининга лекарств4.
3D-сфероидная культура имеет особое значение для исследований рака, поскольку она может устранить разрыв между клетками и их окружением, уменьшая потребность в трипсинизации или лечении коллагеназой, необходимой для подготовки монослоев опухолевых клеток к 2D-культурам. Опухолевые сфероиды позволяют изучать, как нормальные и злокачественные клетки получают и реагируют на сигналы из своего окружения5 , и являются важной частью исследований биологии опухолей.
По сравнению с монослоем 3D-культуры, состоящие из различных типов клеток, по своим структурным и функциональным свойствам напоминают опухолевые ткани и поэтому подходят для изучения метастазирования и инвазии опухолевых клеток. Вот почему такие сфероидные модели способствуют ускорению исследований рака6.
Сфероиды также помогают разрабатывать технологию создания органоидов человека, потому что биология тканей и органов очень сложна для изучения, особенно у людей. Прогресс в культивировании стволовых клеток позволяет разрабатывать 3D-культуры, такие как органоиды, состоящие из стволовых клеток и тканевых предшественников, а также различные типы зрелых (тканевых) клеток из органа с некоторыми функциональными характеристиками, такими как реальный орган, которые могут быть использованы для моделирования развития органов, заболеваний, но их также можно считать полезными в регенеративной медицине7.
Первичные гепатоциты человека обычно используются для изучения in vitro биологии гепатоцитов человека, функции печени и лекарственно-индуцированной токсичности. Культуры гепатоцитов человека имеют два основных недостатка, во-первых, ограниченную доступность первичной ткани, такой как гепатоциты человека, и, во-вторых, склонность гепатоцитов к быстрой дедифференцировке в 2D-культуре, тем самым теряя свою специфическую функцию гепатоцитов8. 3D-культуры печени превосходят в этом отношении и недавно были изготовлены из дифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs)9. Биоинженерные печеночные 3D-сфероиды представляют особый интерес для изучения развития, токсичности, генетических и инфекционных заболеваний печени, а также при открытии лекарств для лечения заболеваний печени10. Наконец, они также могут быть использованы клинически, зная, что острые заболевания печени имеют уровень смертности почти 80%, биоискусственная печень и / или сфероиды печени потенциально могут спасти этих пациентов, обеспечивая частичную функцию печени до тех пор, пока не будет найден подходящий донор11.
Мы разработали протокол генерации сфероидов печени человека с использованием плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови (BD-PSCs), для получения сфероидов разного размера, содержащих от 4000 до 1 x 106 клеток, и проанализировали их с помощью световой микроскопии и иммунофлуоресценции. Мы также проверили способность гепатоцит-специфической функции, оценив экспрессию ферментов цитохрома P450 3A4 (CYP3A4) и 2E1 (CYP2E1), принадлежащих к семейству цитохрома P450, которые играют важную роль в клеточном и лекарственном метаболизме в процессе детоксикации12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Печень является основным органом в организме человека со многими важными биологическими функциями, такими как детоксикация метаболитов. Из-за тяжелой печеночной недостаточности, такой как цирроз печени и/или вирусный гепатит, во всем мире ежегодно умирает около 2 миллионов человек. Тр…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы особенно благодарны за техническую помощь, оказанную Оксаной и Джоном Гринакр. Эта работа была поддержана ACA CELL Biotech GmbH Гейдельберг, Германия.
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
Referências
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease – A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
