Humana leversfäroider från perifert blod för leversjukdomsstudier
Summary
Här presenterar vi en icke-genetisk metod för att generera humana autologa leversfäroider med hjälp av mononukleära celler isolerade från perifert blod vid steady-state.
Abstract
Mänskliga leverceller kan bilda en tredimensionell (3D) struktur som kan växa i kultur i några veckor och bevara deras funktionella kapacitet. På grund av sin natur att kluster i odlingsrätterna med låga eller inga vidhäftningsegenskaper bildar de aggregat av flera leverceller som kallas humana leversfäroider. Bildandet av 3D-leversfäroider bygger på levercellernas naturliga tendens att aggregera i frånvaro av ett vidhäftande substrat. Dessa 3D-strukturer har bättre fysiologiska svar än celler, som ligger närmare en in vivo-miljö . Användning av 3D-hepatocytkulturer har många fördelar jämfört med klassiska tvådimensionella (2D) kulturer, inklusive en mer biologiskt relevant mikromiljö, arkitektonisk morfologi som återmonterar naturliga organ samt en bättre förutsägelse avseende sjukdomstillstånd och in vivo-liknande svar på läkemedel. Olika källor kan användas för att generera sfäroider, som primär levervävnad eller odödliga cellinjer. 3D-levervävnaden kan också konstrueras genom att använda humana embryonala stamceller (hESC) eller inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) för att härleda hepatocyter. Vi har erhållit humana leversfäroider med hjälp av blod-härledda pluripotenta stamceller (BD-PSC) genererade från omanipulerat perifert blod genom aktivering av humant membranbundet GPI-bundet protein och differentierat till humana hepatocyter. BD-PSC-härledda humana leverceller och humana leversfäroider analyserades genom ljusmikroskopi och immunofenotypning med användning av humana hepatocytmarkörer.
Introduction
Under de senaste åren har tredimensionella (3D) sfäroidodlingssystem blivit ett viktigt verktyg för att studera olika områden inom cancerforskning, läkemedelsupptäckt och toxikologi. Sådana kulturer väcker stort intresse eftersom de överbryggar klyftan mellan tvådimensionella (2D) cellodlingsmonolager och komplexa organ1.
I frånvaro av en vidhäftande yta, jämfört med 2D-cellkulturen, är bildningen av sfäroider baserad på den naturliga affiniteten hos dessa celler till kluster i 3D-form. Dessa celler organiserar sig i grupper som består av en eller flera typer av mogna celler. Fria från främmande material interagerar dessa celler med varandra som i sin ursprungliga mikromiljö. Cellerna i 3D-kulturen är mycket närmare och har en korrekt orientering mot varandra, med högre extracellulär matrisproduktion än 2D-kulturer, och utgör en nära naturlig miljö 2.
Djurmodeller har länge använts för att studera mänsklig biologi och sjukdomar3. I detta avseende finns det inneboende skillnader mellan människor och djur, vilket gör att dessa modeller inte är helt lämpliga för extrapolativa studier. 3D-odlingssfäroider och organoider representerar ett lovande verktyg för att studera vävnadsliknande arkitektur, interaktion och överhörning mellan olika celltyper som förekommer in vivo och kan bidra till att minska eller till och med ersätta djurmodeller. De är av särskilt intresse för att studera patogenesen av leversjukdomar samt plattformar för läkemedelsscreening4.
3D-sfäroidodling är av särskild betydelse för cancerforskning eftersom den kan eliminera diskontinuiteten mellan cellerna och deras miljö genom att minska behovet av trypsinisering eller kollagenasbehandling som behövs för att förbereda tumörcellens monolager för 2D-kulturer. Tumörsfäroider möjliggör studier av hur normala kontra maligna celler tar emot och svarar på signaler från sin omgivning5 och är en viktig del av tumörbiologiska studier.
Jämfört med monolagret liknar 3D-kulturer bestående av olika celltyper tumörvävnader i deras strukturella och funktionella egenskaper och är därför lämpliga för att studera metastaser och invasion av tumörceller. Det är därför sådana sfäroidmodeller bidrar till att påskynda cancerforskningen6.
Sfäroider hjälper också till att utveckla tekniken för att skapa mänskliga organoider eftersom vävnads- och organbiologi är mycket utmanande att studera, särskilt hos människor. Framsteg inom stamcellsodling gör det möjligt att utveckla 3D-kulturer som organoider bestående av stamceller och vävnadsprogenitorer samt olika typer av mogna (vävnads) celler från ett organ med vissa funktionella egenskaper som ett riktigt organ som kan användas för att modellera organutveckling, sjukdomar, men de kan också anses vara användbara inom regenerativ medicin7.
Primära humana hepatocyter används vanligtvis för att studera in vitro-biologi av humana hepatocyter, leverfunktion och läkemedelsinducerad toxicitet. Kulturer av humana hepatocyter har två huvudsakliga nackdelar, för det första den begränsade tillgängligheten av primär vävnad som humana hepatocyter, och för det andra tendensen hos hepatocyter att snabbt dedifferentiera i 2D-kultur och därigenom förlora sin specifika hepatocytfunktion8. 3D-leverkulturer är överlägsna i detta avseende och har nyligen framställts av differentierade mänskliga embryonala stamceller (hESC) eller inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC)9. Bioengineered hepatiska 3D-sfäroider är av särskilt intresse för att studera utveckling, toxicitet, genetiska och infektionssjukdomar i levern, liksom vid läkemedelsupptäckt för behandling av leversjukdomar10. Slutligen har de också potential att användas kliniskt, med vetskap om att akuta leversjukdomar har en dödlighet på nästan 80%, bioartificiella lever- och / eller leversfäroider kan potentiellt rädda dessa patienter genom att tillhandahålla partiell leverfunktion tills en lämplig givare kan hittas11.
Vi har etablerat ett protokoll för generering av humana leversfäroider med hjälp av blod-härledda pluripotenta stamceller (BD-PSC) för att förbereda sfäroider av olika storlek innehållande 4000 till 1 x 106 celler och analyserat dem med hjälp av ljusmikroskopi och immunofluorescens. Vi testade också förmågan hos hepatocytspecifik funktion och bedömde uttrycket av cytokrom P450 3A4 (CYP3A4) och 2E1 (CYP2E1) enzymer som tillhör cytokrom P450-familjen som har viktiga roller i cellulär och läkemedelsmetabolism genom avgiftningsprocessen12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Levern är ett viktigt organ i människokroppen med många viktiga biologiska funktioner, såsom avgiftning av metaboliter. På grund av svår leversvikt som cirros och / eller viral hepatit finns det nästan 2 miljoner dödsfall per år över hela världen. Levertransplantationer rankas på andra plats i solida organtransplantationer över hela världen, men endast cirka 10% av det nuvarande behovet tillgodoses22.
Primära humana hepatocyter (PHH) används ofta för at…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är särskilt tacksamma för det tekniska biståndet från Oksana och John Greenacre. Detta arbete stöddes av ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
Referências
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease – A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
