Humane leversfæroider fra perifert blod til undersøgelser af leversygdomme
Summary
Her præsenterer vi en ikke-genetisk metode til at generere humane autologe leversfæroider ved hjælp af mononukleære celler isoleret fra steady-state perifert blod.
Abstract
Humane leverceller kan danne en tredimensionel (3D) struktur, der er i stand til at vokse i kultur i nogle uger og bevare deres funktionelle kapacitet. På grund af deres natur at klynge i kulturskålene med lave eller ingen klæbende egenskaber danner de aggregater af flere leverceller, der kaldes humane leversfæroider. Dannelsen af 3D-leversfæroider er afhængig af levercellernes naturlige tendens til at aggregere i fravær af et klæbende substrat. Disse 3D-strukturer har bedre fysiologiske reaktioner end celler, som er tættere på et in vivo-miljø . Brug af 3D-hepatocytkulturer har adskillige fordele sammenlignet med klassiske todimensionelle (2D) kulturer, herunder et mere biologisk relevant mikromiljø, arkitektonisk morfologi, der samler naturlige organer samt en bedre forudsigelse vedrørende sygdomstilstand og in vivo-lignende reaktioner på lægemidler. Forskellige kilder kan bruges til at generere sfæroider, som primært levervæv eller udødeliggjorte cellelinjer. 3D-levervævet kan også konstrueres ved hjælp af humane embryonale stamceller (hESC’er) eller inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er) til at udlede hepatocytter. Vi har opnået humane leversfæroider ved hjælp af blodafledte pluripotente stamceller (BD-PSC’er) genereret fra umanipuleret perifert blod ved aktivering af humant membranbundet GPI-bundet protein og differentieret til humane hepatocytter. De BD-PSC’er-afledte humane leverceller og humane leversfæroider blev analyseret ved lysmikroskopi og immunofænotypning ved anvendelse af humane hepatocytmarkører.
Introduction
I de senere år er tredimensionelle (3D) sfæroidkultursystemer blevet et vigtigt redskab til at studere forskellige områder af kræftforskning, lægemiddelopdagelse og toksikologi. Sådanne kulturer skaber stor interesse, fordi de bygger bro mellem todimensionelle (2D) cellekulturmonolag og komplekse organer1.
I mangel af en klæbende overflade sammenlignet med 2D-cellekulturen er dannelsen af sfæroider baseret på disse cellers naturlige affinitet til klyngedannelse i 3D-form. Disse celler organiserer sig i grupper bestående af en eller flere typer modne celler. Fri for fremmede materialer interagerer disse celler med hinanden som i deres oprindelige mikromiljø. Cellerne i 3D-kultur er meget tættere og har en ordentlig orientering mod hinanden med højere ekstracellulær matrixproduktion end 2D-kulturer og udgør et tæt på det naturlige miljø 2.
Dyremodeller er blevet brugt i lang tid til at studere menneskelig biologi og sygdomme3. I denne henseende er der iboende forskelle mellem mennesker og dyr, hvilket gør disse modeller ikke helt egnede til ekstrapolative undersøgelser. 3D-kultursfæroider og organoider repræsenterer et lovende værktøj til at studere vævslignende arkitektur, interaktion og krydstale mellem forskellige celletyper, der forekommer in vivo og kan bidrage til at reducere eller endda erstatte dyremodeller. De er af særlig interesse for at studere patogenesen af leversygdomme samt lægemiddelscreeningsplatforme4.
3D-sfærisk kultur er af særlig betydning for kræftforskning, da det kan eliminere diskontinuiteten mellem cellerne og deres miljø ved at reducere behovet for trypsinisering eller kollagenasebehandling, der er nødvendig for at forberede tumorcellemonolagene til 2D-kulturer. Tumorsfæroider muliggør undersøgelse af, hvordan de normale versus ondartede celler modtager og reagerer på signaler fra deres omgivelser5 og er en vigtig del af tumorbiologiske undersøgelser.
Sammenlignet med monolaget ligner 3D-kulturer, der består af forskellige celletyper, tumorvæv i deres strukturelle og funktionelle egenskaber og er derfor egnede til at studere metastase og invasion af tumorceller. Derfor bidrager sådanne sfæroidmodeller til at fremskynde kræftforskningen6.
Sfæroider hjælper også med at udvikle teknologien til at skabe humane organoider, fordi vævs- og organbiologi er meget udfordrende at studere, især hos mennesker. Fremskridt inden for stamcellekultur gør det muligt at udvikle 3D-kulturer som organoider bestående af stamceller og vævsstamfædre samt forskellige typer modne (vævs) celler fra et organ med nogle funktionelle egenskaber som et ægte organ, der kan bruges til at modellere organudvikling, sygdomme, men de kan også betragtes som nyttige i regenerativ medicin7.
Primære humane hepatocytter anvendes normalt til undersøgelse af in vitro-biologi af humane hepatocytter, leverfunktion og lægemiddelinduceret toksicitet. Kulturer af humane hepatocytter har to hovedulemper, for det første den begrænsede tilgængelighed af primært væv som humane hepatocytter, og for det andet hepatocytternes tendens til hurtigt at dedifferentiere i 2D-kultur og derved miste deres specifikke hepatocytfunktion8. 3D-leverkulturer er overlegne i denne henseende og er for nylig blevet fremstillet af differentierede humane embryonale stamceller (hESC’er) eller inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er)9. Bioengineered hepatiske 3D-sfæroider er af særlig interesse for at studere udvikling, toksicitet, genetiske og smitsomme sygdomme i leveren samt i lægemiddelopdagelse til behandling af leversygdomme10. Endelig har de også potentialet til at blive brugt klinisk, vel vidende at akutte leversygdomme har en dødelighed på næsten 80%, biokunstig lever og / eller hepatiske sfæroider kan potentielt redde disse patienter ved at give delvis leverfunktion, indtil en passende donor kan findes11.
Vi har etableret en protokol for generering af humane hepatiske sfæroider ved hjælp af blodafledte pluripotente stamceller (BD-PSC’er) til fremstilling af sfæroider af forskellig størrelse indeholdende 4000 til 1 x 106 celler og analyseret dem ved hjælp af lysmikroskopi og immunofluorescens. Vi testede også evnen til hepatocytspecifik funktion og vurderede ekspressionen af cytokrom P450 3A4 (CYP3A4) og 2E1 (CYP2E1) enzymer, der tilhører cytokrom P450-familien, der har vigtige roller i cellulær og lægemiddelmetabolisme gennem afgiftningsprocessen12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leveren er et vigtigt organ i menneskekroppen med mange vigtige biologiske funktioner, såsom afgiftning af metabolitter. På grund af alvorlige leversvigt som skrumpelever og / eller viral hepatitis er der næsten 2 millioner dødsfald om året på verdensplan. Levertransplantationer ligger på andenpladsen inden for solide organtransplantationer på verdensplan, men kun ca. 10 % af det nuværende behov er opfyldt22.
Primære humane hepatocytter (PHH) bruges ofte til a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er især taknemmelige for den tekniske bistand fra Oksana og John Greenacre. Dette arbejde blev støttet af ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
Referências
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease – A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
