Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato
Summary
Qui presentiamo un metodo non genetico per generare sferoidi epatici autologhi umani usando cellule mononucleate isolate dal sangue periferico allo stato stazionario.
Abstract
Le cellule epatiche umane possono formare una struttura tridimensionale (3D) in grado di crescere in coltura per alcune settimane, preservando la loro capacità funzionale. A causa della loro natura di raggrupparsi nei piatti di coltura con caratteristiche adesive basse o assenti, formano aggregati di più cellule epatiche che sono chiamate sferoidi epatici umani. La formazione di sferoidi epatici 3D si basa sulla naturale tendenza delle cellule epatiche ad aggregarsi in assenza di un substrato adesivo. Queste strutture 3D possiedono risposte fisiologiche migliori rispetto alle cellule, che sono più vicine a un ambiente in vivo . L’utilizzo di colture di epatociti 3D presenta numerosi vantaggi rispetto alle classiche colture bidimensionali (2D), tra cui un microambiente biologicamente più rilevante, una morfologia architettonica che riassembla gli organi naturali e una migliore previsione dello stato della malattia e delle risposte simili in vivo ai farmaci. Varie fonti possono essere utilizzate per generare sferoidi, come tessuto epatico primario o linee cellulari immortalizzate. Il tessuto epatico 3D può anche essere ingegnerizzato utilizzando cellule staminali embrionali umane (hESC) o cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) per derivare gli epatociti. Abbiamo ottenuto sferoidi epatici umani utilizzando cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSC) generate da sangue periferico non manipolato mediante attivazione di proteine GPI legate alla membrana umana e differenziate in epatociti umani. Le cellule epatiche umane derivate da BD-PSCs e gli sferoidi epatici umani sono stati analizzati mediante microscopia ottica e immunofenotipizzazione utilizzando marcatori di epatociti umani.
Introduction
Negli ultimi anni i sistemi di coltura sferoidale tridimensionale (3D) sono diventati uno strumento importante per studiare varie aree della ricerca sul cancro, della scoperta di farmaci e della tossicologia. Tali colture suscitano grande interesse perché colmano il divario tra monostrati di colture cellulari bidimensionali (2D) e organi complessi1.
In assenza di una superficie adesiva, rispetto alla coltura cellulare 2D, la formazione di sferoidi si basa sulla naturale affinità di queste cellule a raggrupparsi in forma 3D. Queste cellule si organizzano in gruppi costituiti da uno o più tipi di cellule mature. Prive di materiali estranei, queste cellule interagiscono tra loro come nel loro microambiente originale. Le cellule nella coltura 3D sono molto più vicine e hanno un corretto orientamento l’una verso l’altra, con una maggiore produzione di matrice extracellulare rispetto alle colture 2D, e costituiscono un ambiente vicino al naturale 2.
I modelli animali sono stati utilizzati per lungo tempo per studiare la biologia umana e le malattie3. A questo proposito, ci sono differenze intrinseche tra esseri umani e animali, il che rende questi modelli non del tutto adatti per studi estrapolativi. Gli sferoidi e gli organoidi di coltura 3D rappresentano uno strumento promettente per studiare l’architettura simile ai tessuti, l’interazione e la diafonia tra diversi tipi di cellule che si verificano in vivo e possono contribuire a ridurre o addirittura sostituire i modelli animali. Sono di particolare interesse per lo studio della patogenesi delle malattie del fegato e delle piattaforme di screening dei farmaci4.
La coltura sferoidale 3D è di particolare importanza per la ricerca sul cancro in quanto può eliminare la discontinuità tra le cellule e il loro ambiente riducendo la necessità di tripsinizzazione o trattamento con collagenasi necessario per preparare i monostrati delle cellule tumorali per colture 2D. Gli sferoidi tumorali consentono lo studio di come le cellule normali rispetto a quelle maligne ricevono e rispondono ai segnali provenienti dall’ambiente circostante5 e sono una parte importante degli studi di biologia tumorale.
Rispetto al monostrato, le colture 3D costituite da vari tipi di cellule assomigliano ai tessuti tumorali nelle loro proprietà strutturali e funzionali e quindi sono adatte per studiare le metastasi e l’invasione delle cellule tumorali. Ecco perché tali modelli sferoidi stanno contribuendo ad accelerare la ricerca sul cancro6.
Gli sferoidi stanno anche aiutando a sviluppare la tecnologia per creare organoidi umani perché la biologia dei tessuti e degli organi è molto difficile da studiare, in particolare negli esseri umani. I progressi nella coltura di cellule staminali consentono di sviluppare colture 3D come organoidi costituiti da cellule staminali e progenitori tissutali, nonché diversi tipi di cellule mature (tissutali) da un organo con alcune caratteristiche funzionali come un organo reale che può essere utilizzato per modellare lo sviluppo di organi, malattie, ma possono anche essere considerati utili nella medicina rigenerativa7.
Gli epatociti umani primari sono solitamente utilizzati per studiare la biologia in vitro degli epatociti umani, la funzionalità epatica e la tossicità indotta da farmaci. Le colture di epatociti umani presentano due principali inconvenienti, in primo luogo, la limitata disponibilità di tessuto primario come gli epatociti umani e, in secondo luogo, la tendenza degli epatociti a dedifferenziarsi rapidamente nella coltura 2D, perdendo così la loro funzione specifica degli epatociti8. Le colture epatiche 3D sono superiori in questo senso e sono state recentemente prodotte da cellule staminali embrionali umane differenziate (hESC) o cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs)9. Gli sferoidi 3D epatici bioingegnerizzati sono di particolare interesse per lo studio dello sviluppo, della tossicità, delle malattie genetiche e infettive del fegato, nonché nella scoperta di farmaci per il trattamento delle malattie del fegato10. Infine, hanno anche il potenziale per essere utilizzati clinicamente, sapendo che le malattie epatiche acute hanno un tasso di mortalità di quasi l’80%, il fegato bio-artificiale e / o gli sferoidi epatici potrebbero potenzialmente salvare questi pazienti fornendo una funzionalità epatica parziale fino a quando non si trova un donatore adatto11.
Abbiamo stabilito un protocollo per la generazione di sferoidi epatici umani utilizzando cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSCs) per preparare sferoidi di dimensioni diverse contenenti da 4000 a 1 x 106 cellule e analizzarli mediante microscopia ottica e immunofluorescenza. Abbiamo anche testato la capacità della funzione specifica degli epatociti, valutando l’espressione degli enzimi del citocromo P450 3A4 (CYP3A4) e 2E1 (CYP2E1) che appartengono alla famiglia del citocromo P450 che hanno ruoli importanti nel metabolismo cellulare e dei farmaci attraverso il processo di disintossicazione12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il fegato è un organo importante nel corpo umano con molte funzioni biologiche essenziali, come la disintossicazione dei metaboliti. A causa di gravi insufficienza epatica come la cirrosi e / o l’epatite virale, ci sono quasi 2 milioni di morti all’anno in tutto il mondo. I trapianti di fegato sono al secondo posto nei trapianti di organi solidi in tutto il mondo, ma solo circa il 10% del fabbisogno attuale è soddisfatto22.
Gli epatociti umani primari (PHH) sono spess…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono particolarmente grati per l’assistenza tecnica fornita da Oksana e John Greenacre. Questo lavoro è stato sostenuto da ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Germania.
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
Referências
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