Sphéroïdes hépatiques humains provenant du sang périphérique pour les études sur les maladies du foie

Summary

Nous présentons ici une méthode non génétique pour générer des sphéroïdes hépatiques autologues humains en utilisant des cellules mononucléaires isolées du sang périphérique à l’état d’équilibre.

Abstract

Les cellules hépatiques humaines peuvent former une structure tridimensionnelle (3D) capable de croître en culture pendant quelques semaines, préservant ainsi leur capacité fonctionnelle. En raison de leur nature à se regrouper dans les boîtes de culture avec des caractéristiques adhésives faibles ou nulles, ils forment des agrégats de plusieurs cellules hépatiques appelées sphéroïdes hépatiques humains. La formation de sphéroïdes hépatiques 3D repose sur la tendance naturelle des cellules hépatiques à s’agréger en l’absence d’un substrat adhésif. Ces structures 3D possèdent de meilleures réponses physiologiques que les cellules, qui sont plus proches d’un environnement in vivo . L’utilisation de cultures d’hépatocytes 3D présente de nombreux avantages par rapport aux cultures bidimensionnelles classiques (2D), notamment un microenvironnement biologiquement plus pertinent, une morphologie architecturale qui réassemble les organes naturels ainsi qu’une meilleure prédiction de l’état de la maladie et des réponses in vivo aux médicaments. Diverses sources peuvent être utilisées pour générer des sphéroïdes, comme le tissu hépatique primaire ou les lignées cellulaires immortalisées. Le tissu hépatique 3D peut également être modifié en utilisant des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ou des cellules souches pluripotentes induites (CSPhi) pour obtenir des hépatocytes. Nous avons obtenu des sphéroïdes hépatiques humains en utilisant des cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSC) générées à partir de sang périphérique non manipulé par activation de la protéine liée à la GPI liée à la membrane humaine et différenciée aux hépatocytes humains. Les cellules hépatiques humaines dérivées des BD-PSC et les sphéroïdes hépatiques humains ont été analysés par microscopie optique et immunophénotypage à l’aide de marqueurs hépatocytes humains.

Introduction

Au cours des dernières années, les systèmes de culture sphéroïde tridimensionnels (3D) sont devenus un outil important pour étudier divers domaines de la recherche sur le cancer, de la découverte de médicaments et de la toxicologie. De telles cultures suscitent un grand intérêt car elles comblent le fossé entre les monocouches de culture cellulaire bidimensionnelles (2D) et les organes complexes¹.

En l’absence de surface adhésive, par rapport à la culture cellulaire 2D, la formation de sphéroïdes est basée sur l’affinité naturelle de ces cellules pour se regrouper sous forme 3D. Ces cellules s’organisent en groupes constitués d’un ou plusieurs types de cellules matures. Exemptes de corps étrangers, ces cellules interagissent les unes avec les autres comme dans leur microenvironnement d’origine. Les cellules en culture 3D sont beaucoup plus proches et ont une orientation appropriée les unes vers les autres, avec une production de matrice extracellulaire plus élevée que les cultures 2D, et constituent un environnement proche de la nature ².

Les modèles animaux sont utilisés depuis longtemps pour étudier la biologie humaine et les maladies³. À cet égard, il existe des différences intrinsèques entre les humains et les animaux, ce qui rend ces modèles pas tout à fait adaptés aux études extrapolatives. Les sphéroïdes et les organoïdes de culture 3D représentent un outil prometteur pour étudier l’architecture, l’interaction et la diaphonie tissulaires entre différents types de cellules qui se produisent in vivo et peuvent contribuer à réduire, voire à remplacer, les modèles animaux. Ils présentent un intérêt particulier pour l’étude de la pathogenèse des maladies du foie ainsi que des plateformes de criblage^{de médicaments 4}.

La culture sphéroïde 3D revêt une importance particulière pour la recherche sur le cancer, car elle peut éliminer la discontinuité entre les cellules et leur environnement en réduisant le besoin de trypsinisation ou de traitement par collagénase nécessaire à la préparation des monocouches de cellules tumorales pour les cultures 2D. Les sphéroïdes tumoraux permettent d’étudier comment les cellules normales par rapport aux cellules malignes reçoivent et répondent aux signaux de leur environnement⁵ et constituent une partie importante des études de biologie tumorale.

Par rapport à la monocouche, les cultures 3D composées de différents types de cellules ressemblent aux tissus tumoraux dans leurs propriétés structurelles et fonctionnelles et conviennent donc à l’étude des métastases et de l’invasion des cellules tumorales. C’est pourquoi de tels modèles sphéroïdes contribuent à accélérer la recherche sur le cancer⁶.

Les sphéroïdes aident également à développer la technologie pour créer des organoïdes humains parce que la biologie des tissus et des organes est très difficile à étudier, en particulier chez les humains. Les progrès de la culture de cellules souches permettent de développer des cultures 3D comme des organoïdes constitués de cellules souches et de progéniteurs tissulaires ainsi que différents types de cellules matures (tissulaires) à partir d’un organe présentant certaines caractéristiques fonctionnelles comme un organe réel qui peut être utilisé pour modéliser le développement des organes, les maladies, mais elles peuvent également être considérées comme utiles en médecine régénérative⁷.

Les hépatocytes humains primaires sont généralement utilisés pour étudier in vitro la biologie des hépatocytes humains, la fonction hépatique et la toxicité induite par les médicaments. Les cultures d’hépatocytes humains présentent deux inconvénients principaux, d’une part, la disponibilité limitée de tissus primaires comme les hépatocytes humains, et d’autre part, la tendance des hépatocytes à se dédifférencier rapidement en culture 2D, perdant ainsi leur fonction hépatocytes spécifique⁸. Les cultures hépatiques 3D sont supérieures à cet égard et ont récemment été fabriquées à partir de cellules souches embryonnaires humaines différenciées (CSEh) ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPhi)⁹. Les sphéroïdes hépatiques 3D issus de la bio-ingénierie présentent un intérêt particulier pour étudier le développement, la toxicité, les maladies génétiques et infectieuses du foie, ainsi que la découverte de médicaments pour le traitement des maladies du foie¹⁰. Enfin, ils ont également le potentiel d’être utilisés cliniquement, sachant que les maladies hépatiques aiguës ont un taux de mortalité de près de 80%, le foie bio-artificiel et / ou les sphéroïdes hépatiques pourraient potentiellement sauver ces patients en fournissant une fonction hépatique partielle jusqu’à ce qu’un donneur approprié puisse être trouvé¹¹.

Nous avons établi un protocole pour la génération de sphéroïdes hépatiques humains à l’aide de cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSC) pour préparer des sphéroïdes de tailles différentes contenant 4000 à 1 x 10⁶ cellules et les avons analysés au moyen de la microscopie optique et de l’immunofluorescence. Nous avons également testé la capacité de la fonction spécifique des hépatocytes, en évaluant l’expression des enzymes du cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) et 2E1 (CYP2E1) appartenant à la famille du cytochrome P450 qui jouent un rôle important dans le métabolisme cellulaire et médicamenteux par le processus de désintoxication¹².

Protocol

L’approbation éthique a été obtenue (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) pour effectuer ces expériences et le consentement éclairé a été signé par tous les donneurs avant l’extraction de sang conformément aux directives institutionnelles. 1. Préparation de cellules mononucléées (MNC) à partir de sang périphérique humain (PB) Extraire 30 mL de sang de donneurs sains avec l’aide d’un personnel médical formé selon le protocole standard….

Representative Results

Nous avons réussi à différencier les CSD-BD humaines en cellules progénitrices endodermiques/hépatiques et en hépatocytes en appliquant un protocole en deux étapes. Les changements morphologiques au cours du processus de différenciation hépatique sont illustrés à la figure 1. Les CSP-BD se différencient en hépatocytes passant par trois étapes différentes. La première étape représente la différenciation en cellules endodermiques L4, la deuxième, la différenciation en cell…

Discussion

Le foie est un organe majeur du corps humain avec de nombreuses fonctions biologiques essentielles, telles que la désintoxication des métabolites. En raison d’insuffisances hépatiques graves comme la cirrhose et / ou l’hépatite virale, il y a près de 2 millions de décès par an dans le monde. Les transplantations hépatiques se classent au deuxième rang mondial des transplantations d’organes pleins, mais seulement environ 10% des besoins actuels sont satisfaits²².

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Materials

Albumin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500217	produced in chicken
Albumin Fraction V	Carl Roth GmbH+Co. KG	T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein	Proteintech Germany GmbH	14550-1-AP	rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN	BioLamina	LN111-02	human recombinant
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell Strainer	pluriSelect	43-10040-40
CellSens	Olympus		imaging software
Centrifuge tubes 50 mL	Greiner Bio-One	210270
CEROplate 96 well	OLS OMNI Life Science	2800-109-96
CKX53	Olympus
Commercially available detergent	Procter & Gamble		nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody	Proteintech Germany GmbH	19937-1-AP	rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4	Proteintech Germany GmbH	67110-1-lg	mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18	DakoCytomation	M7010	mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14040091
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm	R. Langenbrinck	01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde 25%	Sigma-Aldrich	G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3	Antibodies online	ABIN1673767	polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488	Antibodies online	ABIN1889284	polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-11008
HCl	Sigma-Aldrich	30721-1LGL
HepatoZYME-SFM	Thermo Fisher Scientific	17705021	hepatocyte maturation medium
HGF	Thermo Fisher Scientific	PHG0324	human recombinant
HNF4α antibody	Sigma-Aldrich	ZRB1457-25UL	clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)	Biomol	Cay18226-100
Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco	Fisher Scientific	A3181501	KSR
KnockOut DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660012	Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303	magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	11140035
Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	50mM
MiniMACS columns	Miltenyi	130-042-201
Nunclon Multidishes	Sigma-Aldrich	D6789	4 well plates
Oncostatin M	Thermo Fisher Scientific	PHC5015	human recombinant
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS sterile	Carl Roth GmbH+Co. KG	9143.2
Penicillin/Streptomycin	Biochrom GmbH	A2213	10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile	Greiner Bio-One	188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red	Antibodies online	ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM	Carl Roth GmbH+Co. KG	9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI	Carl Roth GmbH+Co. KG	HP20.1
Roti Sep 1077 human	Carl Roth GmbH+Co. KG	0642.2
Transthyretin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500378	produced in chicken
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	HFH10	1%