I denne undersøgelse administreres fluorescein-isothiocyanatmærket (FITC) dextran til mus via oral sonde for at evaluere tarmpermeabilitet både in vivo og i plasma- og fækalprøver. Da tarmbarrierefunktionen påvirkes i mange sygdomsprocesser, kan dette direkte og kvantitative assay anvendes inden for forskellige forskningsområder.
Tarmbarriereintegritet er et kendetegn ved tarmsundhed. Mens tarmbarriereintegritet kan vurderes ved hjælp af indirekte markører såsom måling af plasmainflammatoriske markører og bakteriel translokation til milt og lymfeknuder, kvantificerer guldstandarden direkte udvalgte molekylers evne til at krydse tarmslimhindelaget mod systemisk cirkulation. Denne artikel bruger en ikke-invasiv, omkostningseffektiv og lavbelastet teknik til at kvantificere og følge i realtid tarmpermeabiliteten hos mus ved hjælp af fluorescein-isothiocyanatmærket dextran (FITC-dextran). Før oral tilskud med FITC-dextran fastes musene. De serveres derefter med FITC-dextran fortyndet i fosfatbufret saltvand (PBS). En time efter sonden udsættes musene for generel anæstesi ved hjælp af isofluran, og de vivo-fluorescensen visualiseres i et billeddannelseskammer. Denne teknik har til formål at vurdere resterende fluorescens i bughulen og leveroptagelsen, hvilket tyder på portalmigration af den fluorescerende sonde. Blod- og afføringsprøver indsamles 4 timer efter oral sonde, og musene ofres. Plasma- og fækalprøver fortyndet i PBS belægges derefter, og fluorescensen registreres. Koncentrationen af FITC-dextran beregnes derefter ved hjælp af en standardkurve. I tidligere forskning har in vivo-billeddannelse vist, at fluorescens hurtigt spredes til leveren hos mus med en svagere tarmbarriere induceret af en fiberfattig kost, mens det fluorescerende signal hos mus suppleret med fiber for at styrke tarmbarrieren bevares mest i mave-tarmkanalen. Derudover havde kontrolmus i denne undersøgelse forhøjet plasmafluorescens og reduceret fluorescens i afføringen, mens inulin-supplerede mus omvendt havde højere niveauer af fluorescenssignaler i tarmen og lave niveauer i plasmaet. Sammenfattende giver denne protokol kvalitative og kvantitative målinger af tarmpermeabilitet som markør for tarmsundhed.
Tarmbarrieren spiller en vigtig rolle i både sundhed og sygdom. Det kræver en kompleks balance mellem at lade de nødvendige næringsstoffer trænge ind i kredsløbet fra tarmens lumen og samtidig forhindre indtrængning af proinflammatoriske molekyler, såsom patogener eller antigener1. Øget permeabilitet kan skyldes mange gastrointestinale lidelser, såsom leversygdom eller inflammatoriske tarmsygdomme (IBD’er)2,3. For eksempel i ulcerøs colitis (UC), en IBD, fører kronisk inflammation til nedbrydning af stramme kryds, den efterfølgende forstyrrelse af tarmbarrieren og translokation af bakterier, hvilket potentielt opretholder slimhinde og systemisk inflammation4.
Tarmbarriereintegritet er derfor en vigtig markør for tarmsundhed. Imidlertid har nuværende metoder til måling af tarmpermeabilitet mange begrænsninger. For eksempel er metoder til måling af plasmainflammatoriske markører eller bakteriel translokation til milt og lymfeknuder indirekte 5,6. Andre metoder kan være invasive og tidskrævende. Denne artikel beskriver et ikke-invasivt og omkostningseffektivt assay, der direkte og kvantitativt måler tarmpermeabilitet. Dette assay bruger fluorescein-isothiocyanatmærket dextran (FITC-dextran) til at følge tarmpermeabilitet i realtid ved at måle fluorescens in vivo. Derudover kvantificerer måling af FITC-dextranniveauer i plasma og afføring tarmpermeabiliteten (figur 1).
FITC-dextranpermeabilitetsanalysen er tidligere blevet brugt i mange forskellige sammenhænge, herunder i dyremodeller af Parkinsons sygdom7, sepsis8, iskæmisk slagtilfælde9 og forbrændingsskade10. Derudover er dette assay for nylig blevet brugt til at hjælpe med at forstå, hvordan tarmmikrobiomet kan være impliceret i forskellige sygdomsprocesser, og hvordan det kan målrettes eller manipuleres som en potentiel terapeutisk. For eksempel er det blevet brugt til at studere mikrobiom og mikrobiombaserede behandlinger i aldring 11, IBD’er 12, kolorektal cancer13 og autismespektrumforstyrrelse11. Da tarmbarrierefunktionen er impliceret i mange aspekter af sundhed og sygdom, er dette assay blevet brugt bredt. Dens relative enkelhed og lave tidsbyrde gør den ideel til test af in vivo-forhold, der mistænkes for at ændre tarmbarriereintegriteten. Dens kvantitative resultater er nyttige til bestemmelse af effektiviteten af en potentiel behandling.
I denne undersøgelse blev effekten af diæt på tarmbarrierefunktionen evalueret ved hjælp af FITC-dextran-assayet. Tarmpermeabiliteten hos mus, der fik en kontroldiæt, og tarmpermeabiliteten hos mus, der fik en inulinsuppleret diæt, blev sammenlignet. Inulin er et gavnligt oligosaccharid, der har vist sig at forbedre tarmbarrierefunktionen12,13. Til in vivo fluorescensmålinger (baggrund) blev yderligere én ubehandlet mus anvendt som negativ kontrol og fik PBS i stedet for FITC-dextran. Dette eksperiment viser, at FITC-dextran-analysen er et værdifuldt værktøj til evaluering af tarmpermeabilitet.
Tarmbarrierefunktionen er en integreret del af mange forskellige sygdomsprocesser. Derfor er vurdering af tarmpermeabilitet på en ikke-invasiv, omkostningseffektiv og kvantificerbar måde afgørende for nøjagtigt at repræsentere disse sygdomme i dyremodeller. FITC-dextran-analysen giver mulighed for denne repræsentation. Denne protokol involverer dog flere kritiske trin, der skal udføres nøjagtigt for at opnå pålidelige resultater. For det første er det vigtigt at sikre brugen af FITC-dextran i passende størrelse. Til undersøgelse af de vivo-permeabilitet er 4 kDa FITC-dextran den optimale molekylvægt, og når molekylvægten stiger, falder permeabiliteten15. Anvendelse af FITC-dextran med en anden molekylvægt kan således give forvirrende eller upålidelige resultater. Derudover er det vigtigt at notere tidspunktet for hver sonde og justere tidspunkterne for in vivo-dataindsamling og indsamling af plasma og afføring i overensstemmelse hermed. For eksempel, hvis to mus er sondet 10 min fra hinanden, skal in vivo fluorescensaflæsningerne og opsamlingen af afføring og plasma også forekomme 10 min mellemrum. Sammenligning af fluorescensen på samme tidspunkter giver mulighed for en mere nøjagtig repræsentation af forskellene i permeabilitet. Desuden bør den rækkefølge, hvori dyrene fra forskellige grupper testes, skiftes for at undgå en klyngeeffekt på grund af tidspunktet. I stedet for at teste alle dyrene i gruppe A først, derefter alle dyrene i gruppe B anden (AAABBB), anbefales det, at gruppen skiftes efter hvert dyr (ABABAB).
Dette assay kan ændres til kun at omfatte evaluering af plasma- og fækalprøver, hvis der mangler adgang til en billeddannelsesmaskine. Selvom direkte fluorescensbilleddannelse in vivo muliggør visualisering af leverindtag og resterende abdominal fluorescens, giver evaluering af fluorescens i plasma- og fækalprøver stadig en kvantitativ måling af tarmpermeabilitet. Som det beskrevne eksperiment har vist, korrelerer fluorescensniveauerne i plasma og afføring desuden godt med de vivo-billeddannelsen. Derudover kan dette assay ændres til kun at omfatte de vivo-billeddannelsen. Dette gør det muligt for dyrene at blive holdt i live for at fortsætte med at teste andre parametre eller overvåge, hvordan tarmpermeabiliteten ændrer sig over tid. Evnen til at ændre dette assay gør det derfor tilgængeligt, men stadig kvantitativt. Endelig er doseringen på 200 μL 80 mg·ml-1 FITC-dextran , der gives til hver mus, blevet anvendt tidligere og viste sig at være effektiv hos mus med små forskelle i kropsvægt16. Desuden er det vigtigt at bemærke, at alle de mus, der blev brugt i afsnittet om repræsentative resultater, vejede ca. 20 g, hvilket gjorde det muligt at bruge den samme dosis til hver mus. For at tage højde for forskelle i kropsvægt kan FITC-dextran dog administreres i en dosis på 0,6-0,8 mg / g legemsvægt, for eksempel17. Uanset hvilken dosis der anvendes, er det vigtigt at begrænse mængden af gaver til hver mus til mindre end 10 ml · kg − 1 for at forhindre komplikationer eller ubehag18.
Selvom FITC-dextran-analysen giver en effektiv metode til evaluering af tarmbarrierefunktionen, har den stadig nogle begrænsninger. En begrænsning ved denne model er, at den kræver, at musene fastes i flere timer, hvilket betyder, at det er upålideligt at sammenligne disse resultater med dem fra mus, der ikke er blevet fastet. Derudover kan faste påvirke resultaterne i visse modeller, der kræver strenge fodringsplaner, såsom ved måling af blodsukker i dyremodeller for diabetes.
På trods af disse begrænsninger forbliver FITC-dextran-analysen en effektiv metode til analyse af tarmpermeabilitet, da den er kvantitativ, alsidig, omkostningseffektiv og mindre invasiv end mange klassiske metoder. For eksempel er almindelige sonder, der anvendes til måling af tarmpermeabilitet, små saccharidprober eller Cr-EDTA, som har nogle fordele19. Nogle saccharidsonder har dog kun regionsspecifik permeabilitet. Da de hydrolyseres i den distale del af tyndtarmen, giver de ingen indsigt i kolonpermeabilitet19. På den anden side kan Cr-EDTA give information om kolonpermeabilitet, men kræver målinger i 24 timer, hvilket gør tidsbyrden ved denne metode meget højere end FITC-dextran-assay20. Desuden giver ingen af disse metoder direkte in vivo-billeddannelse af dette assay. Derfor giver FITC-dextran-analysen en relativt enkel, direkte og effektiv mulighed sammenlignet med alternative metoder til måling af tarmpermeabilitet.
Endelig er tarmpermeabilitet i sygdomsprocesser som IBD4, Alzheimers sygdom21 og leversygdom2 en vigtig parameter, der kan måles ved hjælp af FITC-dextran-analysen for at forbedre undersøgelserne. For eksempel kan dette assay ved udvikling af nye behandlinger, såsom immunterapier til IBD’er, bruges til at teste effektiviteten af det terapeutiske middel til opretholdelse af tarmbarriereintegritet. I betragtning af at nedsat tarmbarrierefunktion kan være impliceret i at opretholde den kroniske inflammation i UC, for eksempel er det vigtigt at undersøge, hvor godt en terapeutisk beskytter mod øget permeabilitet4. Dette er kun et eksempel, men FITC-dextran-analysen er en tilgængelig og kvantificerbar måde at måle tarmpermeabilitet på mange forskellige områder og aspekter af forskning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (tilskud RGPIN-2018-06442 til MMS). Vi takker dyreanlægget på CRCHUM og Dr. Junzheng Peng fra den kardiovaskulære fænotypeplatform.
50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |