वर्तमान अध्ययन में, फ्लोरेसिन-आइसोथियोसाइनेट-लेबल (एफआईटीसी) डेक्सट्रान को मौखिक गैवेज के माध्यम से चूहों को विवो और प्लाज्मा और फेकल नमूनों दोनों में आंतों की पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए प्रशासित किया जाता है। चूंकि कई रोग प्रक्रियाओं में आंत बाधा समारोह प्रभावित होता है, इस प्रत्यक्ष और मात्रात्मक परख का उपयोग विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में किया जा सकता है।
आंत बाधा अखंडता आंतों के स्वास्थ्य की एक पहचान है। जबकि आंत बाधा अखंडता का मूल्यांकन अप्रत्यक्ष मार्करों जैसे प्लाज्मा भड़काऊ मार्करों के माप और प्लीहा और लिम्फ नोड्स में जीवाणु स्थानांतरण का उपयोग करके किया जा सकता है, स्वर्ण मानक सीधे प्रणालीगत परिसंचरण की ओर आंत म्यूकोसल परत को पार करने के लिए चयनित अणुओं की क्षमता को निर्धारित करता है। यह लेख एक गैर-इनवेसिव, लागत प्रभावी और कम बोझ वाली तकनीक का उपयोग करता है ताकि फ्लोरेसिन-आइसोथियोसाइनेट-लेबल डेक्सट्रान (एफआईटीसी-डेक्सट्रान) का उपयोग करके चूहों में आंतों की पारगम्यता को वास्तविक समय में निर्धारित और पालन किया जा सके। एफआईटीसी-डेक्सट्रान के साथ मौखिक पूरक से पहले, चूहों को उपवास किया जाता है। फिर उन्हें फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में पतला एफआईटीसी-डेक्सट्रान के साथ जोड़ा जाता है। गैवेज के एक घंटे बाद, चूहों को आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके सामान्य संज्ञाहरण के अधीन किया जाता है, और विवो फ्लोरेसेंस को एक इमेजिंग कक्ष में देखा जाता है। इस तकनीक का उद्देश्य पेट की गुहा और यकृत अपटेक में अवशिष्ट प्रतिदीप्ति का आकलन करना है, जो फ्लोरोसेंट जांच के पोर्टल माइग्रेशन का संकेत है। मौखिक गैवेज के 4 घंटे बाद रक्त और मल के नमूने एकत्र किए जाते हैं, और चूहों की बलि दी जाती है। पीबीएस में पतला प्लाज्मा और फेकल नमूने तब चढ़ाए जाते हैं, और प्रतिदीप्ति दर्ज की जाती है। एफआईटीसी-डेक्सट्रान की एकाग्रता की गणना तब एक मानक वक्र का उपयोग करके की जाती है। पिछले शोध में, विवो इमेजिंग में दिखाया गया है कि प्रतिदीप्ति कम फाइबर आहार से प्रेरित कमजोर आंत बाधा के साथ चूहों में यकृत में तेजी से फैलती है, जबकि आंत बाधा को मजबूत करने के लिए फाइबर के साथ पूरक चूहों में, फ्लोरोसेंट सिग्नल ज्यादातर जठरांत्र संबंधी मार्ग में बरकरार रहता है। इसके अलावा, इस अध्ययन में, नियंत्रण चूहों ने प्लाज्मा फ्लोरेसेंस को ऊंचा किया था और मल में प्रतिदीप्ति को कम किया था, जबकि विपरीत, इनुलिन-पूरक चूहों में आंत में प्रतिदीप्ति संकेतों का उच्च स्तर और प्लाज्मा में निम्न स्तर था। सारांश में, यह प्रोटोकॉल आंत के स्वास्थ्य के लिए मार्कर के रूप में आंतों की पारगम्यता के गुणात्मक और मात्रात्मक माप प्रदान करता है।
आंत बाधा स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसके लिए आवश्यक पोषक तत्वों को आंतों के लुमेन से परिसंचरण में प्रवेश करने की अनुमति देने के बीच एक जटिल संतुलन की आवश्यकता होती है, जबकि साथ ही साथ रोगजनकों या एंटीजन जैसे प्रो-भड़काऊ अणुओं के प्रवेश कोरोका जाता है। बढ़ी हुई पारगम्यता कई गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों के कारण हो सकती है, जैसे कि यकृत रोग या सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) 2,3। उदाहरण के लिए, अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी), एक आईबीडी में, पुरानी सूजन तंग जंक्शनों के टूटने, आंत बाधा के बाद के विघटन और बैक्टीरिया के स्थानांतरण की ओर ले जाती है, संभावित रूप से म्यूकोसल और प्रणालीगत सूजनको बनाए रखती है।
इसलिए, आंत बाधा अखंडता आंत स्वास्थ्य का एक महत्वपूर्ण मार्कर है। हालांकि, आंतों की पारगम्यता के माप के लिए वर्तमान तरीकों में कई सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, प्लाज्मा भड़काऊ मार्करों या प्लीहा और लिम्फ नोड्स में जीवाणु स्थानांतरण को मापने के तरीके अप्रत्यक्ष 5,6 हैं। अन्य तरीके आक्रामक और समय-गहन हो सकते हैं। यह लेख एक गैर-इनवेसिव और लागत प्रभावी परख का वर्णन करता है जो सीधे और मात्रात्मक रूप से आंतों की पारगम्यता को मापता है। यह परख विवो में प्रतिदीप्ति को मापकर वास्तविक समय में आंतों की पारगम्यता का पालन करने के लिए फ्लोरेसिन-आइसोथियोसाइनेट-लेबल डेक्सट्रान (एफआईटीसी-डेक्सट्रान) का उपयोग करती है। इसके अलावा, प्लाज्मा और मल में एफआईटीसी-डेक्सट्रान के स्तर को मापने से आंतों की पारगम्यता निर्धारित होती है (चित्रा 1)।
एफआईटीसी-डेक्सट्रान पारगम्यता परख का उपयोग पहले कई अलग-अलग संदर्भों में किया गया है, जिसमें पार्किंसंस रोग7, सेप्सिस8, इस्केमिक स्ट्रोक9 और बर्न इंजरी10 के पशु मॉडल शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, इस परख का उपयोग हाल ही में यह समझने में सहायता के लिए किया गया है कि आंत माइक्रोबायोम को विभिन्न रोग प्रक्रियाओं में कैसे फंसाया जा सकता है और इसे संभावित चिकित्सीय के रूप में कैसे लक्षित या हेरफेर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग उम्र बढ़ने 11, आईबीडी12, कोलोरेक्टल कैंसर13 और ऑटिज़्म स्पेक्ट्रम विकार11 में माइक्रोबायोम और माइक्रोबायोम-आधारित चिकित्सीय का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। चूंकि आंत बाधा समारोह स्वास्थ्य और बीमारी के कई पहलुओं में फंसा हुआ है, इस परख का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। इसकी सापेक्ष सादगी और कम समय का बोझ इसे आंत बाधा अखंडता को बदलने के लिए संदिग्ध विवो स्थितियों के परीक्षण के लिए आदर्श बनाता है। इसके मात्रात्मक परिणाम संभावित उपचार की प्रभावशीलता निर्धारित करने के लिए उपयोगी हैं।
इस अध्ययन में, आंत बाधा समारोह पर आहार के प्रभाव का मूल्यांकन एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख का उपयोग करके किया गया था। एक नियंत्रण आहार प्राप्त करने वाले चूहों की आंतों की पारगम्यता और इनुलिन-पूरक आहार प्राप्त करने वाले चूहों की आंतों की पारगम्यता की तुलना की गई थी। इनुलिन एक लाभकारी ऑलिगोसेकेराइड है जिसे आंत बाधा समारोह12,13 में सुधार करने के लिए दिखाया गया है। विवो फ्लोरेसेंस माप (पृष्ठभूमि) में, एक अतिरिक्त अनुपचारित माउस का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था और एफआईटीसी-डेक्सट्रान के बजाय पीबीएस प्राप्त किया गया था। यह प्रयोग दर्शाता है कि एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख आंतों की पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है।
आंत बाधा समारोह कई अलग-अलग रोग प्रक्रियाओं का एक अभिन्न अंग है। इस प्रकार, पशु मॉडल में इन बीमारियों का सटीक प्रतिनिधित्व करने के लिए एक गैर-आक्रामक, लागत प्रभावी और मात्रात्मक तरीके से आंतों की पारगम्यता का आकलन करना आवश्यक है। एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख इस प्रतिनिधित्व के लिए संभावना प्रदान करता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं जिन्हें विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए सटीक रूप से पूरा किया जाना चाहिए। सबसे पहले, उचित आकार के एफआईटीसी-डेक्सट्रान का उपयोग सुनिश्चित करना आवश्यक है। विवो पारगम्यता में जांच के लिए, 4 केडीए एफआईटीसी-डेक्सट्रान इष्टतम आणविक भार है, और जैसे ही आणविक भार बढ़ता है, पारगम्यता15 कम हो जाती है। इस प्रकार, एक अलग आणविक भार के एफआईटीसी-डेक्सट्रान का उपयोग भ्रामक या अविश्वसनीय परिणाम प्रदान कर सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक गैवेज के समय को नोट करना और विवो डेटा संग्रह और तदनुसार प्लाज्मा और मल के संग्रह के लिए समय बिंदुओं को समायोजित करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, यदि दो चूहों को 10 मिनट की दूरी पर रखा जाता है, तो विवो फ्लोरेसेंस रीडिंग और मल और प्लाज्मा का संग्रह भी 10 मिनट अलग होना चाहिए। एक ही समय बिंदुओं पर प्रतिदीप्ति की तुलना करने से पारगम्यता में अंतर का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व होता है। इसके अलावा, जिस क्रम में विभिन्न समूहों के जानवरों का परीक्षण किया जाता है, उसे समय के कारण क्लस्टरिंग प्रभाव को रोकने के लिए वैकल्पिक किया जाना चाहिए। पहले समूह ए में सभी जानवरों का परीक्षण करने के बजाय, फिर समूह बी सेकंड (एएएबीबीबी) में सभी जानवरों का परीक्षण करने के बजाय, समूह को प्रत्येक जानवर (एबीएबीबी) के बाद स्विच करने की सिफारिश की जाती है।
इमेजिंग मशीन तक पहुंच की कमी होने पर इस परख को केवल प्लाज्मा और फेकल नमूनों के मूल्यांकन को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। हालांकि विवो में प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति इमेजिंग यकृत सेवन और अवशिष्ट पेट प्रतिदीप्ति के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, प्लाज्मा और फेकल नमूनों में प्रतिदीप्ति का मूल्यांकन अभी भी आंतों की पारगम्यता का मात्रात्मक माप प्रदान करता है। इसके अलावा, जैसा कि वर्णित प्रयोग द्वारा प्रदर्शित किया गया है, प्लाज्मा और मल में प्रतिदीप्ति स्तर विवो इमेजिंग के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित हैं। इसके अतिरिक्त, इस परख को केवल विवो इमेजिंग में शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह जानवरों को अन्य मापदंडों का परीक्षण जारी रखने या निगरानी करने के लिए जीवित रखने की अनुमति देता है कि समय के साथ आंतों की पारगम्यता कैसे बदलती है। इस परख को संशोधित करने की क्षमता, इसलिए, इसे सुलभ बनाती है, फिर भी मात्रात्मक है। अंत में, प्रत्येक माउस को दिए गए 80 mg.mL-1 FITC-dextran के 200 μL की खुराक का उपयोग पहले किया गया था और शरीर के वजन16 में छोटे अंतर वाले चूहों में प्रभावी दिखाया गया था। इसके अलावा, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उपयोग किए जाने वाले सभी चूहों का वजन लगभग 20 ग्राम था, जिससे प्रत्येक माउस के लिए एक ही खुराक का उपयोग किया जा सकता था। शरीर के वजन में अंतर के लिए, हालांकि, एफआईटीसी-डेक्सट्रान को 0.6-0.8 मिलीग्राम / जी शरीर के वजन की खुराक पर प्रशासित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए17। महत्वपूर्ण रूप से, उपयोग की जाने वाली खुराक के बावजूद, जटिलताओं या असुविधा को रोकने के लिए प्रत्येक माउस में गाव की मात्रा को 10 एमएल-किलो -1 से कम तक सीमित करना महत्वपूर्णहै।
हालांकि एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख आंत बाधा समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है, फिर भी इसकी कुछ सीमाएं हैं। इस मॉडल की एक सीमा यह है कि इसके लिए चूहों को कई घंटों तक उपवास करने की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है कि इन परिणामों की तुलना उन चूहों से करना अविश्वसनीय है जिन्हें उपवास नहीं किया गया है। इसके अतिरिक्त, उपवास कुछ मॉडलों में परिणामों को प्रभावित कर सकता है जिनके लिए सख्त भोजन कार्यक्रम की आवश्यकता होती है, जैसे कि मधुमेह के लिए पशु मॉडल में रक्त शर्करा को मापते समय।
इन सीमाओं के बावजूद, एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख आंतों की पारगम्यता का विश्लेषण करने के लिए एक प्रभावी तरीका बना हुआ है क्योंकि यह मात्रात्मक, बहुमुखी, लागत प्रभावी और कई शास्त्रीय तरीकों की तुलना में कम आक्रामक है। उदाहरण के लिए, आंतों की पारगम्यता को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली सामान्य जांच छोटे सैकराइड जांच या सीआर-ईडीटीए हैं, जिनकेकुछ फायदे हैं। हालांकि, कुछ सैकराइड जांच में केवल क्षेत्र-विशिष्ट पारगम्यता होती है। चूंकि वे छोटी आंत के बाहर के हिस्से में हाइड्रोलाइज्ड होते हैं, इसलिए वे कोलोनिक पारगम्यता19 में कोई अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते हैं। दूसरी ओर, सीआर-ईडीटीए कोलोनिक पारगम्यता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है लेकिन 24 घंटे के लिए माप की आवश्यकता होती है, जिससे इस विधि का समय बोझ एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख20 की तुलना में बहुत अधिक हो जाता है। इसके अलावा, इनमें से कोई भी विधि इस परख के विवो इमेजिंग में प्रत्यक्ष प्रदान नहीं करती है। इसलिए, आंतों की पारगम्यता को मापने के लिए वैकल्पिक तरीकों की तुलना में एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख अपेक्षाकृत सरल, प्रत्यक्ष और प्रभावी विकल्प प्रदान करती है।
अंत में, रोग प्रक्रियाओं जैसे आईबीडी4, अल्जाइमर रोग21, और यकृत रोग2 में, आंतों की पारगम्यता एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जिसे अध्ययन में सुधार के लिए एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख का उपयोग करके मापा जा सकता है। उदाहरण के लिए, आईबीडी के लिए इम्यूनोथेरेपी जैसे नए उपचार विकसित करने में, इस परख का उपयोग आंत बाधा अखंडता को बनाए रखने के लिए चिकित्सीय की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। यह देखते हुए कि बिगड़ा हुआ आंत बाधा समारोह यूसी में पुरानी सूजन को बनाए रखने में फंसाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, यह जांचना कि एक चिकित्सीय बढ़ी हुई पारगम्यता के खिलाफ कितनी अच्छी तरह से रक्षा करता है, महत्वपूर्ण है। यह केवल एक उदाहरण है, लेकिन एफआईटीसी-डेक्सट्रान परख कई अलग-अलग क्षेत्रों और अनुसंधान के पहलुओं में आंतों की पारगम्यता को मापने का एक सुलभ और मात्रात्मक तरीका है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एमएमएस को आरजीपीआईएन-2018-06442 अनुदान) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम सीआरसीएचयूएम में पशु सुविधा और कार्डियोवैस्कुलर फेनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म से डॉ जुनझेंग पेंग को धन्यवाद देते हैं।
50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
BD Microtainer Tubes – With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available – A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |